Étude des mécanismes pathogéniques dépendants des microtubules dans les progéniteurs neuronaux conduisant aux malformations corticales

Study of microtubule-dependent pathogenic mechanisms in neural progenitors leading to cortical malformations

• Auteur / Autrice : Donia Zaidi
• Direction : Fiona Francis
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Soutenance le 12/05/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut du Fer à Moulin (Paris ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Nathalie Spassky
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alexandre Baffet, Alexandre Benmerah
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Emilie Pacary, Frédéric Causeret

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microcéphalie

Mutation (biologie)

Malformations

Cortex cérébral

Réseaux neuronaux (physiologie)

Développement neurologique

Mots clés libres

Progéniteurs neuronaux

Développement cortical

Malformations corticales

Mutations génétiques

Hétérotopie de bande sous-corticale

Microcéphalie et Dysgyrie

Neuronal progenitors

Cortical development

Cortical malformations

Genetic mutations

Subcortical band heterotopia

Microcephaly and Dysgyria

Résumé

Les cellules de glie radiaire apicale (RG) sont des cellules clés du développement cortical, capables d'auto-renouvellement ou de génération neuronale, possédant un noyau restreint à la zone ventriculaire (VZ) qui migre en fonction des phases du cycle cellulaire via un phénomène nommé migration nucléaire intercinétique (MNI). Les RG ont une forme bipolaire, avec un long processus basal soutenant la migration neuronale et un court processus apical faisant face au ventricule où un cil primaire (PC), ancré à un centrosome modifié (‘corps basal’), émerge et sert de plateforme de signalisation. Des mutations génétiques peuvent altérer le fonctionnement des RG, affectant le développement cortical et conduisant à des malformations corticales. Ces malformations sont associées chez les patients à de l’épilepsie et à des déficiences intellectuelles. Il est donc important de déterminer comment les processus moléculaires et cellulaires mis en jeu au niveau des RG peuvent être perturbés par des mutations génétiques. Mon travail de thèse a porté sur l’étude de deux gènes mutés conduisant à deux malformations corticales rares. Tout d’abord, le gène codant pour la chaine lourde de la protéine motrice dynéine (DYNC1H1) a été retrouvé muté chez des patients présentant une malformation corticale complexe avec une microcéphalie (petit cerveau) et une dysgyrie (défauts de gyrifications). Lors de mon travail de thèse, j’ai étudié les RG à la mi-corticogenèse dans un modèle murin Knock-In (KI) pour ce gène, reproduisant une mutation faux sens retrouvée chez un patient, en le comparant avec un modèle murin muté pour ce même gène mais conduisant à des neuropathies périphériques. Nous avons découvert des anomalies de MNI, de cycle cellulaire et de migration neuronale. Également, des défauts d’organelles tels que les mitochondries et l’appareil de Golgi ont été identifiés dans les RG, et sont spécifiques à la mutation faux-sens conduisant à la malformation corticale. Deuxièmement, l'hétérotopie sous-corticale (SH) est une malformation caractérisée par la présence anormale de neurones dans la substance blanche. Le gène codant pour EML1 (Echinoderm microtubule associated protein like 1) a été retrouvé muté chez certains patients SH. Lorsqu’Eml1 est muté chez la souris, une proportion de RG se retrouvent en dehors de la VZ, suggérant qu’elles se détachent coté apical. Au niveau apical, des anomalies de PC et des corps basaux ont été décrits. En étudiant un nouveau modèle de souris mutant, inactivé pour Eml1, mon travail s'est concentré sur les altérations subcellulaires et cellulaires des RG afin de comprendre les mécanismes pathogéniques conduisant à leur détachement et donc à la formation de SH. Etudiant les RG en interphase, en analysant les centrosomes, j’ai déterminé que leur structure est affectée dans les cellules de patients et de souris mutante, et ces défauts sont résolus par la stabilisation des microtubules. Le recrutement de protéines aux centrosomes est altéré et la protéine centrosomale Cep170 s'est avérée être un partenaire d'interaction spécifique d’EML1, cette interaction étant perdue quand EML1 présente une mutation SH. Les centrosomes et le PC étant intimement liés au cycle cellulaire, j’ai poursuivi par l'analyse du cycle cellulaire des RG et identifié des altérations de sa cinétique à deux stades de développement. Le séquençage de l'ARN des cellules uniques a permis d'identifier des dérèglements dans l'expression des gènes du cycle cellulaire. Le détachement anormal des RG est plus massif au début du développement que plus tard, ce qui suggère que les altérations de centrosomes et du cycle cellulaire à ce stade peuvent être en amont du détachement anormal des RG. Mon travail de thèse apporte ainsi de nouveaux éléments essentiels à la compréhension des mécanismes altérés dans les progéniteurs neuronaux dans le contexte de malformations corticales rares.

In mammals, cortical development is a finely regulated process that leads to the formation of a functional cortex. Apical radial glial cells (RG) are key progenitor cells du ring cortical development, capable of self-renewal or neuronal generation, with a soma restricted to the ventricular zone (VZ) in rodents. Their nucleus migrates according to the phases of the cell cycle by a process called interkinetic nuclear migration (INM). RG have a bipolar shape, with a long basal process supporting neuronal migration and a short apical process facing the ventricle where a primary cilium (PC), anchored to a modified centrosome (‘basal body’), emerges and detects molecules present in the embryonic cerebrospinal fluid. Genetic mutations can alter the function of RG, affecting cortical development and leading to cortical malformations. These malformations are associated in patients with epilepsy, intellectual disabilities and also neuropsychiatric disorders. It is therefore important to determine how the molecular and cellular processes involving RG can be disrupted by genetic mutations. Thus, my thesis work focused on the study of mutations affecting two different genes in the context of two rare cortical malformations. First, the gene encoding for the motor protein dynein heavy chain (DYNC1H1) was found mutated in patients with a complex cortical malformation associated with microcephaly (small brain) and dysgyria (gyri defects). We generated a Knock-In (KI) mouse model for this gene, reproducing a missense mutation found in a patient. During my thesis, I studied RG at mid-corticogenesis of this KI model and, by comparing it with a mouse model mutant for the same gene but leading to peripheral neuropathies, we showed RG alterations specific to the KI model. We found abnormalities in INM, cell cycle and neuronal migration. Also, defects of key organelles, such as mitochondria and Golgi apparatus were identified in progenitors and are specific in the cortical malformation KI model. Secondly, subcortical heterotopia (SH) is a cortical malformation characterized by the abnormal presence of neurons in the white matter. Mutations in the gene coding for EML1 (Echinoderm microtubule associated protein like 1) were identified in certain SH patients. When Eml1 is mutated in mice, numerous RG are found in basal positions of the cortical wall outside the VZ, suggesting that they detach apically. Within the apical process, abnormal PC formation and basal bodies were described. By studying a new mutant mouse model where Eml1 is inactivated, my work focused on subcellular and cellular alterations of RG to understand the pathogenic mechanisms leading to their detachment and thus to SH formation. In interphase RG, focusing on mechanisms upstream of PC formation, I analyzed centrosomes and determined that their structure is affected in patient and mouse mutant cells, and these defects are rescued by stabilizing microtubules. Recruitment of key centrosomal proteins is altered early in development, and the centrosomal protein Cep170 was found to be a specific interacting partner of EML1, this interaction being lost when EML1 carries a patient mutation. Because centrosomes and cilia are intimately linked to the cell cycle, I proceeded to analyze the RG cell cycle and identified alterations in cell cycle kinetics during early and mid-development. Single-cell RNA sequencing at two key developmental stages identified deregulations in cell cycle gene expression. Abnormal RG detachment appears greater in early compared to mid-development, suggesting that centrosomal and cell cycle alterations at this stage may be upstream of abnormal RG detachment. My thesis work thus brings new elements essential to the understanding of the altered mechanisms in neural progenitors related to rare cortical malformations.