Intérêt des peptides bi-fonctionnels dans le traitement des cancers. Application au carcinome hépatocellulaire

Bi-functional peptides : interest in cancer treatment. Application to hepatocellular carcinoma

• Auteur / Autrice : Eric Savier
• Direction : Olivier Scatton, Angelita Rebollo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie intégrée
• Date : Soutenance le 14/04/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physiologie, Physiopathologie et Thérapeutique (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherche Saint-Antoine (Paris ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Chang-Zhi Dong
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Benoît Barrou
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Olivier Rosmorduc, Jean-Charles Nault

Mots clés

Mots clés contrôlés

Souris de laboratoire

Leucémie lymphoïde chronique

Emploi en thérapeutique

Peptides

Cancer -- Thérapeutique

Carcinome hépatocellulaire

Mots clés libres

Peptide

Cancer

Traitement

Carcinome hépatocellulaire

Foie

Leucémie lymphoïde chronique

Peptide

Cancer

Treatment

Hepatocellular carcinoma

Liver

Chronic lymphocytic leukemia

Résumé

Les tumeurs malignes sont la première cause de mortalité dans les pays industrialisés. Parmi les tumeurs solides, le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la 4ème cause de décès dans le monde et son incidence progresse. Les peptides sont de courtes chaines d'acides aminés dont les propriétés biologiques peuvent être utilisés en thérapeutiques. Ainsi les peptides interférant (IP) ont la propriété de bloquer l'interaction entre 2 protéines. D'autres peptides ont la propriété de franchir les membranes biologiques ou cellulaires, les cell penetrating peptides (CPP), parmi lesquels certains ne pénètrent que dans les tissus tumoraux, les tumor-penetrating peptides (TPP). La combinaison d'un TPP avec un IP produit des peptides bi-fonctionnel (TPP-IP). Le but de cette thèse était d'étudier l'efficacité des TPP-IP dans des modèles de leucémie lymphoïde chronique humaine (LLC), in-vitro et in-vivo et des cellules humaines de CHC. Les résultats obtenus, publiés dans 6 articles étaient les suivants : • A partir de protéines dont les interactions sont connues, la technique du PEPscan, permettait d'identifier des candidats IP en nombre relativement faible. Les résultats du PEPscan ont été comparés à des modélisations in silico. Sous réserve des informations structurelles disponibles sur les protéines, ces 2 méthodes sont concordantes et encourageantes. • Le site d'interaction entre les TPP et le récepteur membranaire NRP-1 est situé sur le domaine b1 de NRP-1 par modélisation in silico. • C9h est un IP qui interfère entre les protéines PP2A et Caspase 9. La constante d'affinité entre C9h et PP2A a été mesurée et était proche de la constante d'affinité entre PP2A et Caspase 9. • Les TTP (iRGD, LinTT1, TT1 et RPARPAR) avec ou sans un IP qui bloque l'interaction entre PP2A et SET, pouvaient pénétrer dans les cellules B des patients souffrants de LLC et dans les hépatocytes de CHC et induisaient une apoptose. Inversement, l'internalisation était minime dans les cellules B ou hépatocytes normaux. Ces 4 TPP-IP étaient faiblement dégradés dans du sérum humain. L'iRGD-IP augmentait significativement la survie dans un modèle murin de xénogreffe de LLC. • Les 4 peptides bi-fonctionnels (iRGD-IP, RPARPAR-IP, LinTT1-IP, TT1-IP) (IP bloque l'interaction PP2A/SET) ont été testés sur hépatocytes malins ou non et l'internalisation peptidique était corrélée de manière logarithmique à la quantité de récepteur exprimée à la surface des cellules ainsi qu'à un score d'agressivité tumorale. L'internalisation induisait une apoptose des hépatocytes malins uniquement. • TT1-IP et LinTT1-IP prolongeaient la survie de souris immunodéficientes greffées avec une lignée tumorale humaine de LLC, mais seul TT1-IP avait un effet significatif. La captation in-vivo de TT1-IP fluorescent après marquage par le Cy7, était plus importante chez une souris porteuse de cellules de LLC. Dans ce modèle, RPARPAR-IP n'avait pas d'effet sur la survie. Pourtant, l'apoptose induite sur les cellules tumorales par TT1-IP, LinTT1-IP et RPARPAR-IP était comparable. Aucun effet apoptotique n'a été observé avec IP seul ou TT1 seul ou sur des cellules saines. Ces derniers résultats démontraient les rôles complémentaires du TPP et de l'IP pour obtenir une apoptose spécifique des cellules tumorales. Sur les souris immunocompétentes nous n'avons pas observé de toxicité de TT1-IP. L'injection intra-péritonéale était suivie d'une concentration plasmatique maximale atteinte en 10 minutes puis d'une clairance plasmatique avec un temps de ½ vie de 28 minutes. Dans du sérum humain, 40% de TT1-IP était détectable après 6h d'incubation montrant ainsi sa lente dégradation par protéolyse. En résumé, les résultats obtenus dans cette thèse laissent penser que l'utilisation de peptides thérapeutiques dans le traitement des cancers est une possibilité réelle. La perspective immédiate est de tester ces peptides bi-fonctionnels sur des modèles murins de xénogreffes de CHC dans un but de validation pré-clinique.

Malignant tumours are the leading cause of death in industrialized countries. Among solid tumours, hepatocellular carcinoma (HCC) is the 4th leading cause of death worldwide and its incidence is increasing. Peptides are small amino acids chains whose biological properties can be used in therapeutics, including that of interfering between two proteins, which are interfering peptides (IP). Other peptides have the property of crossing biological or cellular membranes, named cell penetrating peptides (CPP), among them some penetrate tumor tissues only, that are tumor-penetrating peptides (TPP). The combination of a TPP with an IP produces bi-functional peptides (TPP-IP). The purpose of this thesis was to study the efficacy of TPP-IP in models of human chronic lymphoid leukemia (CLL), in-vitro and in-vivo and human HCC cells. The results were published in 6 articles were as follows: • From proteins whose interactions are known, the PEPscan technique, inexpensive and fast, made possible to identify a relatively small number of IP candidates. PEPscan results were compared to an in silico modelling system. Subject to the available structural information about proteins, these two methods are consistent and encouraging. • The site of interaction between TPP and the NRP-1 membrane receptor is located on the b1 domain of NRP-1 by in silico modelling. • C9h is an IP that interferes between PP2A and Caspase 9 proteins. The affinity constant between C9h and PP2A was measured and was close to the affinity constant between PP2A and Caspase 9. • TTPs (iRGD, LinTT1, TT1, and RPARPAR) with or without an IP that blocks the interaction between PP2A and SET, was internalized into the B cells of patients with CLL and HCC hepatocytes and induced apoptosis. Conversely, internalization was minimal in normal B cells or hepatocytes. These 4 TPP-IPs were weakly degraded in human serum. iRGD-IP significantly increased survival in a murine xenograft model of LLC. • The 4 bi-functional peptides (iRGD-IP, RPAR-IP, LinTT1-IP, TT1-IP) (IP blocked the PP2A/SET interaction) were tested on malignant or non-malignant hepatocytes and peptide internalization was logarithmically correlated with the amount of receptor expressed on the cell surface as well as a tumor aggressiveness score. Internalization led to apoptosis of malignant hepatocytes only. • TT1-IP and LinTT1-IP (IP blocked the PP2A/SET interaction) extended the survival of immunodeficient mice grafted with a human LLC tumour line, but only TT1-IP had a significant effect. In vivo uptake of fluorescent Cy7 labelled TT1-IP was greater in a mouse with CLL cells. In this model, RPARPAR-IP had no effect on survival. However, tumour cell-induced apoptosis by TT1-IP, LinTT1-IP and RPARPAR-IP was similar. No apoptotic effect was observed with IP alone or TT1 alone or on healthy cells. This last result demonstrated the complementary roles of TPP and IP in achieving specific tumor cell apoptosis. In immunocompetent mice, no toxicity of TT1-IP was observed. Following an intraperitoneal injection, the plasma concentration reached a maximum peak within 10 minutes before a plasmatic clearance of 28 minutes half-time life. In human serum incubation, 40% of TT1-IP was detectable after 6h showing its slow degradation by proteolysis. In summary, the results obtained in this thesis suggest that the use of therapeutic peptides in cancer treatment is a real possibility. The immediate prospect is to test these bi-functional peptides on a HCC murine xenograft models for pre-clinical validation.