Nouvelle approche thérapeutique dans un modèle cellulaire humain du Syndrome de Brugada

New therapeutic approach in a human cellular model of Brugada Syndrome

• Auteur / Autrice : Marie Gizon
• Direction : Nathalie Neyroud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 20/03/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physiologie, Physiopathologie et Thérapeutique (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de recherche sur les maladies cardiovasculaires, du métabolisme et de la nutrition (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Sonia-Athina Karabina
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Baró, Romain Guinamard, Fabrice Extramiana
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Isabelle Deschenes, Albano Carlo Meli

Mots clés

Mots clés contrôlés

Génome

Thérapie génique

Arythmie

Électrophysiologie

Canaux sodiques

Syndrome de Brugada

Mots clés libres

IPSC

Nav1.5

Édition génomique

Electrophysiologie

Thérapie génique

Arythmie héréditaire

IPSC

Nav1.5

Genome editing

Electrophysiology

Gene therapy

Inherited cardiac arrhythmia

Résumé

Les arythmies cardiaques héréditaires résultent principalement de la présence de variants pathogènes dans les gènes codant des canaux ioniques ou de leurs protéines partenaires. Les nombreuses mutations dans le gène SCN5A, qui code pour la sous-unité du canal sodique dépendant-du-potentiel cardiaque (Nav1.5), clairement identifiées comme responsables de troubles du rythme, soulignent son rôle clé dans l'excitabilité du cœur. Une mutation perte-de-fonction du gène SCN5A est à l'origine de 20% des cas diagnostiqués cliniquement de Syndrome de Brugada (SBr), une arythmie cardiaque héréditaire rare caractérisée par un risque élevé de mort subite par fibrillation ventriculaire. Sachant que les traitements actuels du SBr (défibrillateur implantable, antiarythmiques ou ablation par radiofréquence) sont associés à de nombreux effets secondaires indésirables, nous avons souhaité développer une nouvelle approche thérapeutique du SBr en surexprimant, au moyen d'un vecteur viral, un fragment de Nav1.5 connu pour augmenter le courant sodique, dans un modèle d'haploinsuffisance de SCN5A. Dans un premier temps, nous avons choisi de concevoir un modèle cellulaire humain de déficience de SCN5A, complémentaire du modèle murin Scn5a+/- développé en 2002 par une équipe anglaise et disponible dans notre groupe. Par CRISPR/Cas9, nous avons généré des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC), qui présentent une mutation hétérozygote dans l'exon 2 de SCN5A, à l'origine d'un codon stop prématuré et qui sont capables de se différencier efficacement en cardiomyocytes. Nous avons ensuite étudié le potentiel thérapeutique de la surexpression du fragment de Nav1.5 dans ce modèle humain, mais également dans les souris Scn5a+/-. Nos résultats obtenus in vitro et in vivo ont démontré que cette approche de thérapie génique corrige efficacement les anomalies phénotypiques associées à la déficience de SCN5A et protège les souris du risque arythmique. Nous avons étendu cette nouvelle thérapie à des cardiomyocytes dérivés d'hiPSC issues d'un patient SBr, présentant la mutation hétérozygote SCN5A-A665G responsable d'un codon stop précoce et nous avons montré que la surexpression du fragment de Nav1.5 restaure efficacement les paramètres électrophysiologiques altérés dans ces cellules. Pour conclure, nous avons produit un modèle cellulaire humain constituant un nouvel outil expérimental pour explorer les mécanismes physiopathologiques dans le cadre de maladies associées à une haploinsuffisance de SCN5A. Nous avons, d'autre part, proposé une nouvelle approche thérapeutique du SBr montrant des résultats très prometteurs, avec une correction du phénotype associé à l'haploinsuffisance de SCN5A dans deux types de modèles expérimentaux. Finalement, nous avons initié différentes approches omiques afin, d'une part, de valider la spécificité de l'effet du fragment de Nav1.5 et, d'autre part, d'identifier ses interrelations potentielles avec d'autres acteurs protéiques. Des études ultérieures pour une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à l'effet du fragment de Nav1.5 sont nécessaires pour confirmer son intérêt dans le traitement du SBr.

Inherited cardiac arrhythmias result mainly from the presence of pathogenic variants in genes encoding ion channels or their partner proteins. The numerous mutations in the SCN5A gene, which encodes the cardiac voltage-dependent sodium channel subunit (Nav1.5), clearly identified as responsible for rhythm disorders, highlight its key role in heart excitability. A loss-of-function mutation in the SCN5A gene accounts for 20% of clinically diagnosed cases of Brugada syndrome (BrS), a rare inherited cardiac arrhythmia characterized by a high risk of sudden death by ventricular fibrillation. Knowing current treatments for BrS (implantable defibrillator, antiarrhythmic drugs, or radiofrequency ablation) are associated with several undesirable side effects, we aimed to develop a new therapeutic approach for BrS by viral vector-mediated overexpression of a Nav1.5 fragment, known to increase sodium current, in a model of SCN5A haploinsufficiency. First, we chose to create a human cellular model of SCN5A deficiency, complementary to the Scn5a+/- mouse model developed in 2002 by an English team and available in our group. Using CRISPR/Cas9, we generated human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), which have a heterozygous mutation in exon 2 of SCN5A, causing a premature stop codon, and which can differentiate efficiently into cardiomyocytes. We then investigated the therapeutic potential of Nav1.5 fragment overexpression in this human model, but also in Scn5a+/- mice. Our in vitro and in vivo results demonstrated this gene therapy approach effectively corrects the phenotypic abnormalities associated with SCN5A deficiency and protects mice from arrhythmic risk. We extended this new therapy to hiPSC-derived cardiomyocytes from a BrS patient carrying the heterozygous SCN5A-A665G mutation responsible for a premature stop codon and showed the Nav1.5 fragment overexpression effectively restores the altered electrophysiological parameters in these cells. In conclusion, we have produced a human cellular model constituting a new experimental tool to explore pathophysiological mechanisms in diseases associated with SCN5A haploinsufficiency. We have also proposed a new therapeutic approach for BrS showing very promising results, with a correction of the phenotype associated with SCN5A haploinsufficiency in two types of experimental models. Finally, we initiated different omics approaches to validate the specificity of the Nav1.5 fragment effect and to identify its potential interrelations with other proteins. Further studies are needed for a better understanding of the molecular mechanisms underlying the Nav1.5 fragment effect and to confirm its interest in the treatment of BrS.