Mécanismes développementaux orchestrant la différenciation des cellules souches pluripotentes induites en cellules souches hématopoïétiques

Developmental mechanisms orchestrating the production of hematopoietic stem cells from induced human pluripotent stem cells

• Auteur / Autrice : Olivier Piau
• Direction : Thierry Jaffredo, Hélène Lapillonne, Laurence Guyonneau-Harmand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Soutenance le 21/04/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de biologie du développement (Paris ; 1997-....)
• Jury : Président / Présidente : Bruno Fève
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Laure-Emmanuelle Zaragosi, Georges Lacaud
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Laurent David, Estelle Duprez

Mots clés

Mots clés contrôlés

Différenciation (biologie)

Séquençage des acides nucléiques

Cellules souches pluripotentes induites

Cellules souches hématopoïétiques

Mots clés libres

Cellules souches hématopoïétiques

Cellules pluripotentes induites

Biologie du développement

ScRNAseq

Corps embryoïdes

Hematopoietic stem cells

Pluripotent induced stem cells

Developmental biology

ScRNAseq

Embryoid bodies

Résumé

Les cellules souches hématopoïétiques sont à l'origine de la production de l'ensemble des cellules sanguines dans notre corps. Ces cellules souches sont générées pendant une phase courte du développement au niveau de l'aorte de l'embryon. Cette production aortique est unique et les cellules souches hématopoïétiques produites au cours de cette période sont les fondatrices du système hématopoïétique définitif. Malgré quelques avancées notables, les capacités d'amplification des cellules souches hématopoïétiques restent encore insuffisantes. Quant à la production ex-vivo de cellules souches hématopoïétiques, il n'existe pas encore de protocole utilisable pour des applications cliniques. Mon projet de thèse porte sur l'analyse d'un protocole de différenciation de cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules souches hématopoïétiques. Il est basé sur la formation de corps embryoïdes et leur maturation en une seule étape de 17 jours de culture en utilisant une combinaison nouvelle et spécifique de cytokines et de facteurs de croissance sans stroma et sans transgènes. Ce protocole produit des cellules souches hématopoïétiques capables de prises de greffe sériées dans des souris immunodéprimées irradiées. Grâce à des analyses transcriptomiques en cellules uniques réalisées à différents jours du protocole de différenciation, j'ai pu caractériser les différents types cellulaires produits. A l'issue des 17 jours de différenciation, les corps embryoïdes produisent des cellules des lignages mésodermiques, endodermiques et ectodermiques, ainsi que des cellules présentant un profil extra-embryonnaire dont la présence a pu être confirmée par immunofluorescence. La comparaison avec des jeux de données publics d'aortes embryonnaires humaines séquencées au moment de la production des cellules souches hématopoïétiques a montré la présence de cellules endothéliales présentant un profil similaire entre les cellules aortiques et celles de nos corps embryoïdes. De plus, des cellules présentant une signature transcriptomique proche des cellules souches hématopoïétiques embryonnaires humaines ont pu être identifiées. Ainsi, notre protocole semble récapituler la genèse des cellules souches hématopoïétiques dans l'aorte à partir d'une transition endothélio-hématopoïétique similaire à celle qui se produit in-vivo dans l'embryon humain. Enfin, l'analyse transcriptomique en cellule unique des moelles de souris greffées a pu montrer que les cellules humaines injectées sont capables de récapituler l'ensemble des lignages hématopoïétiques. Mon travail de thèse apporte donc une meilleure compréhension de la production ex-vivo des cellules souches hématopoïétiques à partir de cellules pluripotentes induites, tout en fournissant des éclairages sur les mécanismes développementaux orchestrant leur apparition in vivo.

Hematopoietic stem cells are the rare cells that give rise to all hematopoietic cells in the human body. Unfortunately, our organism is not able to produce them outside a short window of embryonic development in the fetal aorta. Therefore, hematopoietic stem cell transplantation is often the only therapeutic solution for many patients. To expand the pool of available hematopoietic stem cells, two solutions have been proposed: proliferation of hematopoietic stem cells and de novo production from pluripotent stem cells. Despite some considerable progress, current methods for proliferation of hematopoietic stem cells are still inadequate. There is still no clinically suitable protocol for ex vivo generation of hematopoietic stem cells from pluripotent stem cells. My PhD project focuses on the analysis of a new differentiation protocol for human induced pluripotent stem cells into hematopoietic stem cells. This one-step protocol is based on the differentiation of embryoid bodies in 17 days of culture using a novel and specific combination of cytokines and growth factors. This stroma- and transgene-free procedure is capable of generating serially transplantable hematopoietic stem cells in irradiated, immunocompromised mice. Using single-cell transcriptomic datasets performed at different time points in the differentiation protocol, I was able to characterize the different cell types that were produced. Embryoid bodies produced cells of the mesodermal, endodermal, and ectodermal lineages after 17 days of differentiation, as well as some cells with an extra-embryonic phenotype, the presence of which was confirmed by immunofluorescence experiments. Our data set was compared with published data sets of human embryonic aorta at the time of hematopoietic stem cell production. Endothelial cells with a similar transcriptomic phenotype between the embryonic aorta and embryoid bodies were detected. In addition, cells corresponding to the transcriptional signature of embryonic hematopoietic stem cells were detected. Thus, our protocol appears to reproduce the generation of hematopoietic stem cells from the aorta through an endothelial-to-hematopoietic transition similar to that in vivo. Finally, single-cell transcriptome analysis of the bone marrow of the transplanted mice showed that the injected human cells recapitulated all hematopoietic lineages. The results of my dissertation provide a better understanding of our protocol for ex vivo production of hematopoietic stem cells while providing insight into the developmental mechanisms that control their production in vivo.