Fonction des Meteorins dans le guidage des axones commissuraux et leur rôle en tant que nouveaux régulateurs de la configuration gauche-droite dans l'embryon de poisson zèbre

Function of Meteorins in commissural axon guidance and their role as novel regulators of left-right patterning in the zebrafish embryo

• Auteur / Autrice : Fanny Eggeler
• Direction : Filippo Del Bene
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 10/03/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cerveau, cognition, comportement (Paris ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de la vision (Paris ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Alessandra Pierani
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie Bréau, Pierre-Luc Bardet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marion Coolen, Juan Ramon Martinez-Morales

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biologie du développement

Développement

Danio rerio

Développement neurologique

Flux axonal

Mots clés libres

Guidage des axones

Développement

Meteorin

Structuration embryonnaire

Établissement de l'axe gauche-droite

Axon guidance

Development

Meteorin

Embryonic patterning

Left-right axis establishment

Résumé

L'un des principaux objectifs de la neurobiologie du développement est de comprendre comment les axones des neurones nouveau-nés peuvent atteindre leurs partenaires synaptiques corrects en suivant des chemins précis et bien définis, guidés par un réseau complexe d'interactions récepteur/ligand (par exemple, netrin/DCC ; slit/robo). Bien qu'un grand nombre de molécules de guidage axonal ait déjà été caractérisé, le tableau est loin d'être complet et un certain nombre de facteurs de guidage restent à découvrir. Les travaux précédents du laboratoire ont généré des allèles de perte de fonction pour les trois gènes du poisson zèbre de la famille des protéines sécrétées Meteorin (Metrn). De façon remarquable, nous avons pu caractériser des défauts de développement axonal spécifiques chez ces poissons mutants, y compris des défauts dans plusieurs populations de neurones commissuraux. Soutenus par nos résultats préliminaires, nous avons émis l'hypothèse que les Metrn jouent un rôle important au cours du développement du SNC des vertébrés et du franchissement de la ligne médiane axonale, en particulier dans le guidage des axones commissuraux. Par conséquent, l'objectif de mon projet de doctorat est d'étudier la fonction des Metrn chez le poisson zèbre, d'élucider leurs voies de signalisation biochimique et, surtout, d'identifier le ou les récepteurs encore inconnus. Metrn a d'abord été découvert comme un facteur neurotrophique sécrété qui favorise la croissance des neurites in vitro. Il est exprimé dans les progéniteurs neuronaux radiaux et la glie radiale. Chez les vertébrés, les Metrn sont hautement conservés et comprennent deux membres chez les mammifères et trois chez le poisson zèbre (Metrn, Metrnl1 et Metrnl2). Chaque gène Metrn ou Metrnl code pour une protéine d'environ 300 acides aminés contenant une séquence signal N-terminale ainsi qu'un domaine de type Netrin à l'extrémité C-terminale. Une partie de mon projet de thèse consistait à évaluer la localisation des protéines Metrn in vivo et à caractériser leur activité sur le développement des axones commissuraux chez le poisson zèbre. Dans ce but, j'ai réalisé des hybridations in situ en double fluorescence pour comparer les expressions de metrn et metrnl1 à l'expression du facteur de guidage axonal bien établi Slit. Les résultats ont montré que metrn et metrnl1 sont co-localisés avec slit1a, slit1b et slit2 au niveau de la plaque de plancher à 2dpf. J'ai également validé la conservation de ce modèle d'expression chez la souris. Cette colocalisation soutient le rôle des Metrns comme nouveaux acteurs dans le guidage axonal le long des Slits et d'autres facteurs impliqués dans ce processus. Par le biais de la qPCR et de l'hybridation in situ, j'ai découvert non seulement que les facteurs nodaux étaient significativement altérés chez les mutants triple metrn, mais aussi que chez le poisson zèbre de type sauvage, en particulier metrnl1 est exprimé plus tôt que prévu (avant 6hpf). De plus, j'ai observé des mouvements aléatoires ou symétriques du cœur et des boucles chez les mutants triples, similaires à ceux décrits chez les mutants spaw et lefty. Ensemble, ces observations soulèvent l'hypothèse que les Metrns pourraient également interagir avec les facteurs Nodal et jouer un rôle dans le patterning gauche-droite.

One of the major goals of developmental neurobiology is to understand how axons of newborn neurons can reach their correct synaptic partners by following precise and well-defined paths guided by a complex network of receptor/ligand interactions (e.g. netrin/DCC; slit/robo) Although a big set of axon guidance molecules has been already characterized, the whole picture is far from being complete and a number of guidance factors still remain to be discovered. Previous work in the laboratory has generated loss-of-function alleles for all three zebrafish genes from the Meteorin (Metrn) family of secreted proteins. Remarkably, we could characterize specific axonal development defects in these mutant fish including defects in several commissural neuron populations. Supported by our preliminary results, we hypothesized that Metrns play an important role during the development of the vertebrate CNS and axonal midline crossing, especially in commissural axon guidance. Therefore, the goal of my PhD project is to investigate the function of Metrns in zebrafish, to elucidate their biochemical signaling pathways, and, most notably, to identify the as-yet-unknown receptor(s). Metrn was first discovered as a secreted neurotrophic factor which promotes neurite outgrowth in vitro. It is expressed in radial neuronal progenitors and radial glia. In vertebrates Metrns are highly conserved including two members in mammals and three in zebrafish (Metrn, Metrnl1 and Metrnl2). Each Metrn or Metrnl gene codes for a protein of around 300 amino acids containing an N-terminal signal sequence as well as a Netrin-like domain at the C-terminus. One part of my PhD project was to evaluate the Metrns protein localization in vivo and characterize their activity on commissural axons development in zebrafish. With this intent, I performed double fluorescence in situ hybridizations to compare the expressions of metrn and metrnl1 to the expression of the well-established axonal guidance factor Slit. The results showed that metrn and metrnl1 co-localizes with slit1a, slit1b and slit2 at the floorplate at 2dpf. I further validated the conservation of this expression pattern in mouse. This colocalization supports the role of Metrns as novel players in axonal guidance along Slits and other factors implicated in this process. Furthermore, it has been reported that nodal, lefty as well p-smad2 expression is downregulated in Meteorin-null ES-cells.Via qPCR and in situ hybridization I discovered not only that Nodal factors were significantly altered in triple metrn mutants but also that in wild-type zebrafish, especially metrnl1 is expressed earlier than previously assumed (earlier than 6hpf). Additionally, I observed randomized or symmetric heart jogging and looping in triple mutants, similar to the ones described in spaw and lefty mutants. Together, these observations raise the hypothesis that Metrns also could interact with Nodal factors and could play a role in the left-right patterning.