Techniques de spectrométrie de masse pour l'imagerie du sélénium dans des coupes fines de poisson : de la localisation quantitative à l'identification des espèces séléniées

Mass spectrometry techniques for selenium imaging in fish thin-sections : from quantitative localization to selenium species identification.

• Auteur / Autrice : Laurie Labeyrie
• Direction : Sandra Mounicou
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie analytique
• Date : Soutenance le 21/12/2023
• Etablissement(s) : Pau
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale sciences exactes et leurs applications (Pau, Pyrénées Atlantiques ; 1995-)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des sciences analytiques et de physico-chimie pour l'environnement et les matériaux (Pau)
• Jury : Président / Présidente : Brice Bouyssière
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sandra Mounicou, Beatriz Fernandez-Garcia, Maïkel Rosabal Rodriguez, Stéphanie Fontagné, Carlos Afonso
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Beatriz Fernandez-Garcia, Maïkel Rosabal Rodriguez

Mots clés

Mots clés contrôlés

Imagerie

Sélénium

Truite arc-en-ciel

Mots clés libres

Imagerie par ablation laser-ICP MS

Quantification par ablation laser-ICP MS

Sélénium

Truite arc-En-Ciel

Laser ablation-ICP MS imaging

Quantification by laser ablation-ICP MS

Selenium

Rainbow trout

Résumé

La localisation et la connaissance de la concentration d'éléments chimiques et leurs espèces dans les différents organes d'échantillons biologiques permettent d'apporter des informations sur leur métabolisme et leurs effets biologiques. L'ablation laser - ICP MS est une technique clé pour l'imagerie quantitative de métaux à l'échelle du micromètre grâce à sa résolution spatiale (µm) et sa sensibilité de détection (ng.g-1). La quantification en LA-ICP MS des éléments dans les échantillons biologiques est complexe et nécessite le développement de méthodologies fiables. Le sélénium (Se), oligoélément essentiel, est utilisé en supplément alimentaire pour l'aquaculture plus durable en remplacement des farines de poissons et afin de maintenir le système antioxydant des poissons d'élevage. Cependant, le métabolisme du Se n'est pas entièrement élucidé. L'objectif principal de cette thèse était donc de développer des méthodes de quantification du Se par LA-ICP MS pour sa localisation quantitative dans les organes d'alevins de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) de 3 semaines et d'explorer l'identification de ses formes chimiques directement sur tissus. La première partie de la thèse présente la mise en place de deux méthodes de quantification du Se par LA-ICP MS, mais aussi du Hg, un contaminant naturellement retrouvé dans les dérivés de farines de poissons, et d'éléments endogènes (cuivre, zinc, molybdène) dans les alevins. La première méthode est basée sur la production de films polymériques dopés en étalons métalliques pour la calibration et/ou l'étalonnage interne. La deuxième consiste au dopage en métaux de deux matrices biologiques disponibles dans le commerce (muscle de truite et foie de veau) mimant celles des poissons. Des droites de calibration linéaires ont pu être obtenues avec les deux méthodes pour le Cu, Zn, Se et Mo, mais seulement avec les étalons de muscle et de foie pour le Hg. La deuxième partie de la thèse est consacrée à l'application des deux méthodologies à la quantification du Se, Hg, Cu, Zn et Mo dans des coupes d'alevins afin d'étudier les différences d'assimilation dans leurs organes entre différentes conditions de supplémentation en Se et Hg organiques, directe ou via leurs géniteurs, avec des régimes à base de plantes ou de sous-produits de thon. Les images quantitatives obtenues par LA-ICP MS ont permis de montrer qu'une supplémentation directe des alevins en Se et/ou en Hg élève leur concentration dans tous les tissus des alevins, les niveaux les plus élevés sont retrouvés dans le foie, le rein, le muscle et le système digestif. La supplémentation parentale en sélénométhionine a dans tous les cas un impact sur les niveaux de Se des alevins, plus que lorsque le Se provient de sous-produits de thon. Le Hg est faiblement transféré des géniteurs à leurs alevins. Une diminution des niveaux de Hg dans les reins des alevins supplémentés en Se et Hg semble avoir lieu, et pourrait être liée à la présence du Se. La dernière partie de cette thèse porte sur des essais pour identifier des protéines séléniées dans les alevins de truites. L'objectif final étant de mettre en place un protocole de préparation d'échantillon pour l'identification directe des espèces séléniées sur les coupes d'alevin. Tout d'abord, les extraits protéiques des alevins ont été analysés par chromatographie d'exclusion stérique couplée à l'ICP MS. Trois fractions correspondant à des composés séléniés de masses moléculaires différentes ont pu être détectées, de même que trois fractions pour le Hg, dont deux d'entre elles montrent des colocalisations du Se et Hg associés aux protéines. Les protéines ont également été séparées sur gels d'électrophorèse avant marquage avec des anticorps pour tester leur spécificité vis à vis des sélénoprotéines. Les gels analysés par LA-ICP MS ont révélé la présence de Se à faible intensité sur des bandes protéiques à des masses moléculaires d'environ 75 kDa et 40 kDa.

The study of the localisation and the concentration of chemical elements and their species in the different organs of biological samples provide information about their metabolism and their biological effects. Laser ablation - ICP MS is a key technique for the quantitative imaging of metals at the micrometre scale thanks to its spatial resolution (µm) and the sensitivity of detection (µg.g-1). Elemental quantification in biological samples with LA-ICP MS is complex and requires the development of reliable methodologies. Selenium (Se), an essential trace element, is used as a feed supplement for more sustainable aquaculture as a replacement of fishmeal and to maintain the antioxidant system of farmed fish. However, the metabolism of Se is not fully understood. The main objective of this thesis was to develop methodologies for the quantification of Se and other metallic elements by LA-ICP MS for its quantitative localisation in organs and tissues of 3-weeks rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fry and to try to identify its chemical forms. The first part of the thesis presents the development of two methods for the quantification of Se by LA-ICP MS, as well as Hg, a contaminant naturally found in fishmeal derivatives, and endogenous elements (copper, zinc, molybdenum) in fry. The first method is based on the production of polymer films spiked with metallic solutions for calibration and/or internal calibration. The second one involves metal spiking of two commercially available biological matrices (trout muscle and calf liver) mimicking those of fish. Linear calibration curves were obtained with both methods for Cu, Zn, Se and Mo, but only with the muscle and liver standards for Hg. The second part of the thesis is focused on the application of both methodologies to the quantification of Se, Hg, Cu, Zn and Mo in fry sections in order to study the differences in assimilation in their organs between different conditions of organic Se and Hg supplementation, either directly or via their broodstock, with a plant-based diet or tuna by-products. The quantitative images obtained by LA-ICP MS showed that direct supplementation of fry with Se and/or Hg raised their concentration in all fry tissues, with the highest levels found in the liver, kidney, muscle and digestive tract. Parental supplementation with selenomethionine has in all cases an impact on fry Se levels, more than when the Se comes from tuna by-products. Hg is only weakly transferred from broodstock to their fry. A decrease in Hg levels in the kidneys of fry supplemented with both Se and Hg seems to occur, and could be linked to the presence of Se. The final part of this thesis focuses on assays to identify selenized proteins in trout fry. The final objective is to set up a sample preparation protocol for the direct identification of selenium species on fry thin sections. The protein extracts of the fry were analysed by size exclusion chromatography coupled with ICP MS. Three fractions containing selenium compounds of different molecular weights were detected, as well as three fractions for Hg, two of which showing co-localisations of Se and Hg associated with proteins. The proteins were also separated by gel electrophoresis before labelling with antibodies to test their specificity towards selenoproteins. Gels analysed by LA-ICP MS revealed the presence of Se at low intensity on protein bands with molecular mass of around 75 and 40 kDa.