Spéciation du mercure dans les cellules bactériennes en combinant des techniques analytiques.

Mercury speciation in bacterial cells combining analytical techniques

• Auteur / Autrice : Ikram Bakour
• Direction : Mathilde Monperrus, Marie-Pierre Isaure
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie analytique
• Date : Soutenance le 30/06/2023
• Etablissement(s) : Pau
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale sciences exactes et leurs applications (Pau, Pyrénées Atlantiques ; 1995-)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des sciences analytiques et de Physico-chimie pour l'Environnement et les Matériaux
• Jury : Président / Présidente : Rosa del Carmen Rodriguez Martin-Doimeadios
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mathilde Monperrus, Marie-Pierre Isaure, Bjorn Erik Mork, Claudia Cosio, Marisol Goni
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Bjorn Erik Mork, Claudia Cosio

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spéciation

Mercure

Mots clés libres

Spéciation du mercure

Biométhylation et déméthylation du mercure

Bactérie sulfato réductrices

Développement de méthodes analytiques

Chromatographie - Spectrométrie de masse

Mercury speciation

Biomethylation and demethylation of mercury

Sulfate reducing bacteria

Analytical methods development

Chromatography -Mass spectrometry

Résumé

La méthylation du mercure inorganique (Hg(II)) par divers microorganismes possédant le groupe de gènes HgcAB est une étape clé dans la production et la bioaccumulation du méthylmercure neurotoxique (MeHg). Bien que nous sachions aujourd'hui que la méthylation du Hg(II) est effectuée par des protéines HgcAB situées au niveau cytoplasmique, notre compréhension des voies et des facteurs qui contrôlent l'absorption du Hg(II) par ces organismes n'est pas claire. La méthylation microbienne se produit principalement dans des environnements anoxiques, où la spéciation du Hg devrait être régulée par des ligands contenant des thiols ou les sulfures. Cependant, notre compréhension du mécanisme par lequel ces ligands affectent la spéciation et la biodisponibilité du Hg reste limitée. Dans ce contexte, cette étude fait appel à différentes approches de chimie analytique et d'imagerie microscopique, pour étudier la spéciation et les transformations biomoléculaires du Hg au niveau cellulaire chez la bactérie sulfato-réductrice modèle Pseudodesulfovibrio hydrargyri BerOc1 qui méthyle le mercure. Un accent particulier a été mis sur l'étude des interactions des espèces de Hg avec les ligands soufrés tels que les thiols et les sulfures. À cette fin, le développement de méthodes analytiques hautement sélectives et sensibles était essentiel pour détecter les diverses molécules contenant du soufre et les complexes de Hg à des concentrations pertinentes pour les systèmes de culture avec des bactéries méthylantes. Deux techniques basées sur la spectroscopie de fluorescence ont été développées pour quantifier les sulfures et les concentrations totales de thiols. Des approches de spéciation chimiques plus avancées basées sur la LC-MS/MS ont été ensuite développées pour la caractérisation moléculaire de composés thiols libres et de complexes MeHg-thiol. Par la suite, une étude des transformations du Hg utilisant des espèces de mercure enrichies isotopiquement a été réalisée pour étudier le rôle de la spéciation moléculaire du mercure dans la méthylation et déméthylation chez BerOc1. Les expériences ont été réalisées avec et sans l'ajout de ligands soufrés (cysteine et sulfures). Le taux de méthylation (Kmeth) le plus élevé a été obtenu dans des conditions sans ajout de ligands, tandis que l'ajout de cysteine ou sulfures a entrainé une diminution de Kmeth. Dans les conditions sans ajout de ligands soufrés, des modèles de spéciation affinés ont été générés en prenant en compte les thiols produits par BerOc1. Ces modèles ont mis en évidence que le Hg(II) formait des complexes avec une liaison mixte impliquant des thiols biosynthétisés, des ions OH- et des ions Cl-. Nos résultats suggèrent que ces complexes augmentent le taux de formation de MeHg par rapport aux espèces Hg(Cys)2 ou HgS(s) plus stables. En revanche, l'ajout de cystéine ou de sulfures modifiait la spéciation chimique du MeHg, sans impact sur les taux de déméthylation. Enfin, nous avons utilisé une combinaison de techniques d'imagerie à l'échelle cellulaire afin de localiser le mercure et de préciser sa relation avec le soufre sachant que des particules nanométriques de HgS avaient été observées au niveau extracellulaire auparavant. Cette étude visait en particulier à préciser si le soufre provenait de composés soufrés initialement présents dans la cellule ou d'une dégradation de la source de soufre du milieu (sulfate ou cystéine). Pour cela, la bactérie a été pré-cultivée avec 34S ou 32S, le rapport 32S/34S a été mesuré sur les images isotopiques obtenues par NanoSIMS. Les images NanoSIMS ont été ensuite corrélées aux images obtenues TEM couplée à l'analyse X-EDS. Finalement, l'ensemble de ces travaux a contribué à l'étude de la spéciation et des transformations de Hg, permettant de progresser dans la compréhension de la méthylation du Hg chez les microorganismes, cruciale pour la mesure des risques liés au mercure dans l'environnement.

Methylation of inorganic mercury (Hg(II)) by various microorganisms possessing the HgcAB gene cluster is a key step in the production and bioaccumulation of neurotoxic methylmercury (MeHg). Although we now know that Hg(II) methylation is carried out by HgcAB proteins at the cytoplasmic level, our understanding of the pathways and factors that control Hg(II) uptake by these organisms is unclear. Microbial methylation occurs primarily in anoxic environments, where Hg speciation should be regulated by thiol-containing ligands or sulfides. However, our understanding of the mechanism by which these ligands affect Hg speciation and bioavailability remains limited. In this context, this study employs different approaches from analytical chemistry and microscopic imaging to investigate the speciation and biomolecular transformations of Hg at the cellular level in the model sulfate-reducing bacterium Pseudodesulfovibrio hydrargyri strain BerOc1 that methylates Hg. We particularly focused on the interactions of Hg species with sulfur-containing ligands, such as thiols and sulfides. For that, the development of highly selective and sensitive analytical methods is essential for detecting various sulfur-containing molecules and Hg complexes at concentrations relevant to culture systems with methylating bacteria. Two fluorescence spectroscopy-based techniques were developed to quantify the sulfides and total thiol concentrations. More advanced chemical speciation approaches based on liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) have been developed for the molecular characterization of free thiol compounds and MeHg-thiol complexes. Subsequently, a study of Hg transformations using isotopically enriched mercury species (199Hg(II), 202MeHg) was performed to investigate the role of mercury molecular speciation in methylation and demethylation in BerOc1. Experiments were performed with and without the addition of sulfur ligands (cysteine and sulfides). The highest methylation rate (Kmeth) was obtained under conditions without addition of ligands, while addition of cysteine or sulfides resulted in a decrease in Kmeth. By quantitatively determining the Hg-thiol complexes in the extracellular fractions, we showed that Hg(II) was mainly present as Hg(Cys)2 in the presence of cysteine. However, degradation of cysteine to sulfide promotes the formation of Hg(II)-sulfide species over time. Under conditions without the addition of sulfur ligands, refined speciation models were generated taking into account the thiols produced by BerOc1. These models showed that Hg(II) formed complexes with mixed ligation involving biosynthesized thiols, OH- ions, and Cl- ions. Our results suggest that these complexes increase the rate of MeHg formation compared to the more stable Hg(Cys)2 or HgS(s) species. In contrast, the addition of cysteine or sulfides altered the chemical speciation of MeHg, with no impact on demethylation rates. Finally, a combination of imaging techniques at the cellular level was carried out to locate Hg and clarify its relation with sulfur, since nano HgS particles had been previously identified at the extracellular level. Particularly, this study aimed to determine if sulfur from the HgS clusters originated from S initially present in the bacteria or from degradation of S source (cysteine or sulfate) present in the medium. For that, bacteria were precultivated with 34S or 32S, and exposed to Hg with 32S containing cysteine or 34SO4, respectively. The 32S/34S ratio was measured on the isotopes maps obtained by nanoscale secondary ion mass spectrometry (NanoSIMS). NanoSIMS images were then correlated to images obtained by transmission electron microscopy (TEM) combined to X-EDS analysis. Finally, this work has contributed to the investigation of speciation and transformations of Hg, and allowed to progress in the understanding of Hg methylation in microorganisms, which is crucial for the measurement of mercury risks in the environment.