Caractérisation structurale et fonctionnelle de complexes de protéines membranaires et d'oligomères solubles d'intérêt thérapeutique directement par NALIM (Native Liquid MALDI) - TOF MS, une approche originale de spectrométrie de masse

Direct structural/functional characterization of therapeutically relevant membrane protein complexes and soluble oligomers by NALIM (Native Liquid MALDI) - TOF MS, an original mass spectrometry approach

• Auteur / Autrice : Edison Zhamungui Sanchez
• Direction : Martine Cadène
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie. Spectrométrie de masse
• Date : Soutenance le 05/07/2023
• Etablissement(s) : Orléans
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Michel Jault
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Martine Nicole Hélène Beaufour, Reine Nehmé
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Julien Marcoux, Elisabetta Boeri Erba

Mots clés

Mots clés contrôlés

métabolisme

Protéines membranaires

Interactions protéine-protéine

Spectrométrie de masse MALDI

Stoechiométrie

Oligomères

Ligands (biochimie) -- Fixation

Protéines membranaires

Mots clés libres

NALIM

Biologie structurale

Spectrométrie de masse native

Grands complexes

MALDI-TOF

Native Liquid MALDI

Structural biology

Native mass spectrometry

Large complexes

MALDI-TOF

Résumé

Bien que les protéines membranaires (PMs) représentent les deux tiers des cibles thérapeutiques potentielles, seulement 10 % de ces protéines ont été exploitées comme cibles jusqu'à présent. Ceci est dû à un manque d'information structurale, attribué aux défis liés à la production des PMs et au besoin d'agents de solubilisation. De plus, des fonctions biologiques clés dépendent de la formation de grands complexes par le biais d'interactions avec d'autres biomolécules telles que les acides nucléiques, les peptides ou d'autres protéines. Ainsi, la taille de ces complexes (c'est-à-dire, 100 000 Da ou plus) et leur grande hétérogénéité imposent des limitations à leur caractérisation structurale. Au cours de la dernière décennie, la caractérisation de complexes non covalents par spectrométrie de masse native (nMS) est apparue comme un bon complément aux techniques traditionnelles de biologie structurale. Nous montrons ici comment une nouvelle méthode appelée « NAtive LIquid MALDI » (NALIM), qui exploite les avantages intrinsèques de MALDI-TOF MS – une grande tolérance aux contaminants, une faible consommation d'échantillons et une gamme de masse d'analyse théoriquement illimitée - peut répondre aux questions sur la structure des PMs et des complexes biomoléculaires de grande taille. De plus, pour se rapprocher des conditions in vivo de la bicouche lipidique de la membrane native, la méthode NALIM a également été appliquée à la caractérisation de complexes de protéines membranaires dans les proteoliposomes et les vésicules membranaires. À cette fin, des conditions non dénaturantes soigneusement contrôlées, des composants de solution d'échantillon et des paramètres instrumentaux ont été optimisés pour améliorer la stabilité des complexes, ainsi que la résolution et la sensibilité dans la gamme des hautes masses. Grâce à ces optimisations, la méthode NALIM a facilité la caractérisation de divers transporteurs membranaires (par exemple, un transporteur ABC et un canal ionique), de grandes distributions d'oligomères (par exemple, le facteur de transcription ZBTB8A) et de grands complexes moléculaires (complexe Rho-NusG). De plus, le développement de la méthode NALIM a impliqué l'exploration de différentes protéines pour trouver un calibrant approprié pour l'analyse dans la gamme des hautes masses. Une préparation d'alpha1-antitrypsine (α1AT) formant une échelle moléculaire sur une large gamme de masse a été validée comme calibrant. En résumé, l’analyse par NALIM a permis un accès rapide et direct à la caractérisation des PMs et des grands complexes biomoléculaires. Les informations fournies par NALIM ont une valeur significative en biologie et en pharmacologie. Ainsi, la méthode NALIM promet d'être une alternative pour de nouvelles stratégies de découverte de médicaments.

Although membrane proteins (MPs) represent two-thirds of potential therapeutic targets, only 10% of these proteins have been exploited thus far. This is due to a lack of structural information, attributed to the challenges associated with producing MPs and the need for solubilizing agents. Additionally, key biological functions depend on the formation of large complexes through interactions with other biomolecules such as nucleic acids, peptides, or other proteins. Thus, the size of these complexes (i.e.,100,000 Da or higher) and their high heterogeneity impose additional limitations on their structural characterization. Over the past decade, the characterization of noncovalent complexes through native mass spectrometry (nMS) has emerged as avaluable complement to traditional Structural Biology techniques. Here we show how a novel method called Native Liquid MALDI(NALIM), which leverages the inherent strengths of MALDI-TOF MS - high tolerance to contaminants, low sample consumption,and a theoretically limitless mass range of analysis – to answer questions about the structure of MPs and large biomolecularcomplexes. Additionally, to get closer to the in vivo conditions of the native membrane's lipid bilayer, NALIM was also applied tothe characterization of membrane proteins in proteoliposomes and membrane vesicles.To this end, carefully controlled non-denaturing conditions, sample solution components, and instrumental parameters were fine-tuned to enhance complex stability, as well as resolution and sensitivity in the high mass range. Thanks to these optimizations, NALIM facilitated the characterization of diverse membrane transporters (e.g., an ABC transporter and an ion channel), large oligomer distributions (e.g., ZBTB8A transcription factor), and large molecular complexes (Rho-NusG complex). Furthermore, the development of the NALIM method involved exploring different proteins to find a suitable calibrant for high mass range analysis. Apreparation of alpha1-antitrypsin (α1AT) that forms a molecular ladder over a wide mass range was validated as a calibrant.In summary, NALIM enabled rapid and straightforward access to characterizing MPs and large biomolecular complexes. The information provided by NALIM has significant value in biology and pharmacology. Thus, NALIM promises to be an alternative for new strategies of drug discovery. molecular ladder