Etude des altérations cellulaires moléculaires,cellulaires et vasculaires induites par l'apnée du prématuré dans le cervelet de la souris.

Study of molecular, cellular, and vascular alterations induced by apnea of prematurity in the murine cerebellum.

• Auteur / Autrice : Agalic Rodriguez-Duboc
• Direction : Delphine Burel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 05/06/2023
• Etablissement(s) : Normandie
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Normande de biologie intégrative, santé, environnement (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement de préparation de la thèse : Université de Rouen Normandie (1966-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cancer and Brain Genomics (Rouen ; 2022-....)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Dusart
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pascal Dournaud, Anne-Karine Bouzier-Sore, Ludovic Telley
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pascal Dournaud, Anne-Karine Bouzier-Sore

Mots clés

Mots clés contrôlés

Différenciation (biologie)

Transcriptome

Stress oxydatif

Apoptose

Histologie

Chez le nouveau-né

Syndromes des apnées du sommeil

Période périnatale

Anoxie cérébrale

Croissance

Cervelet

Mots clés libres

Cervelet

Développement

Hypoxie intermittente

Périnatal

Apnée du prématuré

Histologie

Apoptose

Stress oxydatif

Transcriptome

Différenciation

Cerebellum

Development

Intermittent hypoxia

Perinatal

Apnea of prematurity

Histology

Apoptosis

Oxidative stress

Transcriptome

Differentiation

Résumé

Le cervelet est impliqué dans diverses fonctions, du contrôle moteur jusqu’aux émotions. À la naissance, le cortex cérébelleux humain est encore immature, ce qui le rend vulnérable aux événements périnataux tels que l'hypoxie. L'apnée du prématuré (ADP) est l'une des principales causes d'hypoxie périnatale, puisqu'elle survient chez plus de 50 % des enfants prématurés. Or, plusieurs relations entre les fonctions cérébelleuses et les déficits observés chez les enfants ayant souffert d'ADP ont été démontrées, mais les mécanismes physio-pathologiques par lesquels l'ADP affecte le cervelet restent mal compris. Ce travail vise à mettre en lumière les mécanismes sous-jacents aux lésions hypoxiques cérébelleuses. A cette fin, nous avons développé un protocole d'hypoxie intermittente (HI), consistant en des cycles répétés de 2 minutes d'hypoxie-réoxygénation (dont 20 secondes à 5% d'O2), entre P2 et P12, 6 heures par jour, qui constitue un modèle murin valide de l'ADP. Dans un premier temps, nous montrons que le cervelet est effectivement sensible à l'HI, et présente un retard de maturation significatif à la fin de notre protocole. De plus, l'hypoxie semble induire une surexpression de gènes impliqués dans la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), qui s'accumulent dans le cervelet. A l'inverse, les gènes codant pour les enzymes antioxydantes sont sous-exprimés après l'HI, ce qui suggère une défaillance du système de défense contre les ROS. L'HI induit également des dommages à long terme, sous la forme de déficits d'apprentissage et de motricité, qui sont associés à la sur-innervation des cellules de Purkinje par les fibres grimpantes. Nous avons complété ces résultats par une étude transcriptomique des gènes impliqués dans la différenciation et la migration cellulaire. Nous avons analysé l'expression de ces gènes par RT-qPCR, à différents stades de développement et dans différents types de cellules, en utilisant la microdissection par capture laser pour séparer les couches cérébelleuses. Ceci nous a permis de déterminer que la période la plus vulnérable à l'HI est le stade P8 chez la souris, au cours duquel un nombre significatif de gènes sont dérégulés dans toutes les couches corticales cérébelleuses. De plus, il semble que les processus impliqués dans le développement du cervelet soient affectés, y compris la prolifération, la différenciation, la connectivité synaptique et la myélinisation. Plusieurs mécanismes compensatoires et neuroprotecteurs sont mis en place pendant et après l'HI, mais ils ne semblent pas suffisamment efficaces compte tenu de la persistance des déficits à l'âge adulte. Enfin, étant donné le lien établi entre l'hypoxie et la vascularisation, nous avons testé un panel de gènes axés sur ces processus et avons trouvé des régulations significatives des facteurs angiogéniques et de croissance. En outre, les résultats préliminaires d'imagerie suggèrent que le cervelet HI a un réseau vasculaire plus lâche et moins volumineux, un facteur qui pourrait participer à la physiopathologie de l'ADP. Nous avons l'intention de poursuivre cet axe de recherche avec des études immunohistochimiques et de transparisation supplémentaires. Dans l'ensemble, les données présentées ici démontrent que le cervelet est affecté par l'HI, et qu’une lésion cérébelleuse est, au moins en partie, responsable des symptômes observés chez les enfants ayant subi une ADP. Ce projet fournit des éléments pour mieux comprendre l'ADP, en reliant les altérations comportementales et histologiques à des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents plausibles. À long terme, il pourrait conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer la prise en charge clinique actuelle de cette pathologie très prévalente.

The cerebellum is involved in diverse functions, from motor control and equilibrium to spatial learning and emotion. At birth, the human cerebellar cortex is still immature, making it vulnerable to perinatal events such as hypoxia. Apnea of prematurity (AOP) is a main cause of perinatal hypoxia, as it occurs in over 50% of preterm infants. Several relationships between cerebellar functions and the deficits observed in children having suffered from AOP have been demonstrated, but the physio-pathological mechanisms by which AoP affects the cerebellum remain poorly understood. This work aims at shedding light on the mechanisms underlying cerebellar hypoxic injury. To this end, we developed an intermittent hypoxia (IH) protocol, consisting of repeated 2-minute cycles of hypoxia-reoxygenation (including 20 seconds at 5% O2), applied between P2 and P12, 6 hours per day, which constitutes a valid murine model of AOP. In a first study, we show that the cerebellum is indeed sensitive to IH, and presents a significant delay in maturation at the end of our IH protocol. In addition, hypoxia seems to induce an overexpression of genes involved in reactive oxygen species (ROS) production, which accumulate in the cerebellum. Conversely, genes coding for antioxidant enzymes are underexpressed after IH, suggesting a failure of the defense system against ROS. IH also induces long-term damage, in the form of learning and motor deficits, which are associated with the over-innervation of Purkinje cells by climbing fibers. We followed these results with a transcriptomic study of genes involved in cell differentiation and migration. We analyzed the expression of these genes by RT-qPCR, in different developmental stages and in different cell types, using laser capture microdissection to separate cerebellar layers. This allowed us to determine that the period most vulnerable to IH is the P8 stage in mice, during which a significant number of genes are dysregulated in all cerebellar cortical layers. Moreover, it seems that all processes involved in cerebellar development are impacted, including proliferation, differentiation, synaptic connectivity, and myelination. Several compensatory and neuroprotective mechanisms are put in place during and after IH, but they do not seem to be sufficiently effective considering the persistence of deficits through adulthood. Finally, given the established connection between hypoxia and vascularization, we tested a gene panel focused on these processes and found significant regulations of angiogenic and growth factors. In addition, preliminary imaging results suggest that IH cerebella have a looser and less voluminous vascular network, a factor that could participate in the pathophysiology of AOP. We aim to pursue this line of inquiry with additional immunohistochemical and clearing studies. Overall, the data presented here demonstrate that the cerebellum is affected by IH, and that its injury is, at least in part, responsible for the symptoms observed in children having experienced AOP. This project provides elements to better understand AOP, by connecting behavioral and histological alterations to plausible underlying cellular and molecular mechanisms. In the long term, it could lead to the identification of novel therapeutic targets to improve the current clinical management of this highly prevalent pathology.