Couplage covalent de protéines au peptidoglycane chez la γ-protéobactérie Dickeya dadantii : étude d’une protéine du système de sécrétion de type II, OutB

Covalent attachment of proteins to the peptidoglycan in the γ-proteobacterium Dickeya dadantii : study of a type II secretion system protein, OutB

• Auteur / Autrice : Xavier Nicolai
• Direction : Vladimir Shevchik
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 20/12/2023
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Evolution Ecosystèmes Microbiologie Modélisation (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie, adaptation et pathogénie (Lyon)
• Jury : Président / Présidente : Florence Wisniewski-Dyé
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Vladimir Shevchik, Cécile Morlot, Géraldine Laloux, Béatrice Py, Michel Arthur, Lionel Ballut
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Cécile Morlot, Géraldine Laloux, Béatrice Py

Mots clés

Mots clés contrôlés

Plantes -- Maladies

Bactéries Gram négatives

Dickeya dadantii

Mots clés libres

T2SS

Peptidoglycane

Bactéries à Gram-négatif

Enveloppe bactérienne

Lipoprotéine de Braun (Lpp)

LD-transpeptidase (Ldt)

Dickeya dadantii

T2SS

Peptidoglycan

Gram-negative bacteria

Bacterial cell envelope

Braun’s lipoprotein (Lpp)

LD-transpeptidase (Ldt)

Dickeya dadantii

Résumé

Dickeya dadantii est une γ-protéobactérie phytopathogène à large spectre d’hôte qui provoque la maladie de la pourriture molle chez les végétaux. Elle sécrète des enzymes dégradant la paroi cellulaire végétale par le système de sécrétion de type II (T2SS), appelé Out. Le système Out est un complexe multiprotéique traversant l'enveloppe bactérienne. L’enveloppe des γ-protéobactéries est constituée de deux membranes qui délimitent un espace extracytoplasmique appelé le périplasme. Une couche de peptidoglycane (PG), située dans le périplasme assure la forme de la cellule et préserve les bactéries du stress osmotique. La lipoprotéine de Braun (Lpp) stabilise l’enveloppe en attachant le PG à la membrane externe par une liaison covalente. Jusqu’à récemment, Lpp était le seul exemple connu de protéine couplée covalemment au PG chez les bactéries à Gram-négatif. Dans ce travail de thèse, nous avons montré qu’OutB, un composant du T2SS de D. dadantii, est couplée au PG de manière covalente comme Lpp. OutB est ancrée dans la membrane interne et possède une région périplasmique qui stabilise le canal du T2SS. L’extrémité C-terminale d’OutB est très similaire à celle de Lpp et nos études ont démontré qu’elle est couplée au PG par la lysine C-terminale. Contrairement au Lpp, qui est une protéine très abondante et agit comme ancrage de la membrane au PG, OutB est exprimée modérément et utilise le PG comme une matrice pour son propre attachement, et pour l’attachement du système Out à l’enveloppe bactérienne. Afin de déchiffrer le mécanisme moléculaire de ce phénomène, une série de mutagenèses dirigées d’OutB a été réalisée et des variants d’OutB de longueur variée ont été construits. Pour évaluer la quantité de variants d'OutB liés au PG, ce dernier a été purifié et analysé par Western blot. Cette étude a été complétée par la mutagenèse dirigée de Lpp suivie de tests fonctionnels des variants, et de l’analyse de leur couplage au PG. Ainsi, nous avons montré que le motif de couplage au PG de Lpp, appelé Lpp-box, est assez permissif aux substitutions chez D. dadantii, et peut permettre l’attachement au PG de protéines assez variées. Nous avons montré que la fusion de la Lpp-box à la protéine périplasmique BlaM a permis l’attachement de cette dernière au PG. Par ailleurs, cette étude a suggéré qu’une pectinase périplasmique, PaeX, qui porte une Lpp-box assez dégénérée, semble également être couplée au PG. Nous avons ensuite montré que deux L,D-transpeptidases de D. dadantii, Ldt03 et Ldt84, sont responsables de l'attachement d’OutB et de Lpp au PG. Ldt03 et Ldt84 ne généraient pas les mêmes profils de liaison de Lpp au PG ce qui suggère que chacune des deux Ldt possède une spécificité enzymatique vis-à-vis de la taille du peptide-tige auquel elles attachent Lpp. Nous avons également montré que les L,D-transpeptidases d’E. coli ont une activité croisée sur la Lpp de D. dadantii, permettant son couplage au PG, bien que les Lpp-boxes des Lpp de ces bactéries soient dissimilaires. Ces travaux montrent que le phénomène d'attachement covalent des protéines au PG chez les γ-protéobactéries ne se limite pas à Lpp et aux porines de la membrane externe, mais qu'il peut également concerner des protéines de la membrane interne, comme OutB, ou périplasmiques, comme la pectinase PaeX. Il est donc probable que ce phénomène soit encore largement sous-estimé chez les bactéries à Gram-négatif.

Dickeya dadantii is a broad-spectrum plant pathogenic γ-proteobacterium that causes soft rot disease. It secretes cell wall degrading enzymes through the type II secretion system (T2SS), called Out. The Out system is a multi-protein complex that crosses the bacterial cell envelope. The cell envelope of γ-proteobacteria is composed of two membranes delimiting an extracytoplasmic compartment called the periplasm that contains a peptidoglycan (PG) layer. The PG provides the cell shape and protects the bacteria from osmotic stress. Braun's lipoprotein (Lpp) stabilizes the bacterial cell envelope by covalent attachment of PG to the outer membrane. Until recently, Lpp was the only known example of a protein covalently attached to the PG in Gram-negative bacteria. In this work, we showed that OutB, a component of the D. dadantii T2SS, is covalently attached to the PG, by the same mechanism as Lpp. OutB is anchored in the inner membrane and possess a periplasmic region that stabilizes the T2SS channel. The C-terminus of OutB is very similar to that of Lpp and our studies have shown that it is attached to the PG via its C-terminal lysine. However, unlike the highly abundant Lpp that plays a structural role by anchoring the outer membrane to the PG, OutB is moderately expressed and uses the PG as a scaffold matrix for its own attachment and for the attachment of the Out system to the bacterial cell envelope. In order to decipher the molecular mechanism of this phenomenon, a series of site-directed mutagenesis of OutB were carried out, and OutB length variants were constructed. To assess the quantity of OutB variants bound to the PG, the PG was purified and analyzed by Western blot. This study was completed by site-directed mutagenesis of Lpp, followed by functional assays of the variants, and by the analysis of their attachment to the PG. We showed that in D. dadantii, the attachment motif of Lpp to the PG, called Lpp-box, tolerates various amino acid substitutions, and could probably allow the attachment of various proteins to the PG. We showed that the fusion of the Lpp-box to the periplasmic protein BlaM enabled its covalent linking to the PG. Furthermore, this study also suggested that a periplasmic pectinase, PaeX, which carries a rather degenerated Lpp-box, seems also to be attached to the PG. Finally, we showed that two L,D-transpeptidases of D. dadantii, Ldt03 and Ldt84, are responsible for the covalent linking of OutB and Lpp to the PG. Ldt03 and Ldt84 did not generate the same binding profiles of Lpp to the PG. This suggests that Ldt03 and Ldt84 have each their own enzymatic specificity with respect to the size of the stem-peptide to which they attach Lpp. Although the Lpp-boxes of Lpp of E. coli and D. dadantii are dissimilar, we showed that the L,D-transpeptidases of E. coli attach Lpp of D. dadantii to the PG. Overall, these results show that the covalent attachment of proteins to the PG in γ-proteobacteria is not limited to Lpp and some outer membrane porins. This phenomenon can also involve inner membrane proteins and periplasmic proteins, such as OutB and the pectinase PaeX. It seems therefore likely that this phenomenon is still largely underestimated, and some other proteins covalently attached to PG remain to be discovered in Gram-negative bacteria.