Développement de la microspectroscopie Brillouin pour l’analyse de microcultures cellulaires 3D

Development of Brillouin microspectroscopy for the analysis of 3D cellular microcultures

• Auteur / Autrice : Pierre Bouvet
• Direction : Thomas Dehoux, Jean-Charles Baritaux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique
• Date : Soutenance le 23/11/2023
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Physique et d’Astrophysique (Lyon)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Lumière Matière
• Jury : Président / Présidente : Alice Nicolas
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thomas Dehoux, Jean-Charles Baritaux, Sophie Brasselet, Marie Foret, Vincent Motto-Ros
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sophie Brasselet, Marie Foret

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectroscopie optoacoustique

Microscopie confocale

Innovation

Spectromètres

Brillouin, Effet

Mots clés libres

Diffusion Brillouin

Spectromètres VIPA

Amas cellulaires

Optoacoustique

Brillouin scattering

VIPA spectrometer

Cell assemblies

Optoacoustics

Résumé

La microspectroscopie Brillouin confocale est une technique non invasive et sans marquage qui permet la caractérisation des propriétés mécaniques des échantillons à des échelles submicrométriques. Au cours des dernières décennies, cette technique s’est rapidement développée, grâce à l’introduction du spectromètre VIPA confocal. L’utilisation de cet instrument offre des avantages pratiques, notamment en réduisant les temps d’acquisition des spectres par rapport aux instruments antérieurs, et en accélérant ainsi les mesures. Cette réduction du temps d’acquisition a ainsi permis à la microspectroscopie Brillouin de s’étendre à la biologie où les problématiques de phototoxicité, complexité des échantillons et temps caractéristiques d’évolutions courts imposent des mesures rapides. Cependant, dans ces systèmes, la confocalité est obtenue en couplant le spectrographe VIPA au microscope à l’aide d’une fibre monomode. Cette technologie s’avère alors difficile à aligner en pratique, instable dans le temps et parfois, encore trop lent pour l’analyse de certains processus biologiques. Dans ce manuscrit, nous présentons ainsi le couplage du spectrographe VIPA au microscope par une fibre multimode. Parce que les amas cellulaires en trois dimensions sont considérés comme les modèles les plus réalistes aujourd’hui des conditions de croissance des cellules in vivo, nous choisissons d’appliquer l’instrument résultant à l’étude de ces amas. Ce choix nous invite alors à choisir des résolutions spatiales supérieures à la longueur d’onde de la lumière incidente, et nous permet donc de profiter du compromis entre confocalité et luminosité pour optimiser l’instrument. Ce manuscrit présente alors une nouvelle approche du spectromètre VIPA qui suit les trois axes suivant : simplifier l’alignement de l’instrument optique, accroître la stabilité du dispositif dans le temps, augmenter la vitesse des mesures. En explorant ces aspects, nous présentons une stratégie qui permet optimise les performances du spectromètre VIPA dans l’étude d’amas cellulaire et permet ainsi de faciliter les études de ces échantillons biologiques par microspectroscopie Brillouin. Le système résultant de cette approche sera alors utilisé expérimentalement pour suivre la morphogénèse d’amas cellulaires creux, à la fois de manière qualitative, en suivant l’apparition du creux, et quantitative, en étudiant les propriétés mécaniques des cellules entourant le creux.

Confocal Brillouin microspectroscopy is a non-invasive and label-free technique enabling the characterization of mechanical properties of samples at sub-moicrometric scales. Over the past decades, this technique has seen significant development in biology, thanks to the introduction of the confocal VIPA spectrometer. The use of this instrument offers practical advantages, notably by reducing spectrum acquisition times compared to previous instruments, thereby accelerating measurements. This reduction in acquisition time has extended Brillouin microspectroscopy to biology, where rapid measurements are paramount due to phototoxicity, sample complexity, and short evolutionary timescales. However, in these systems, confocality is achieved by coupling the VIPA spectrograph to the microscope using a single-mode fiber. The resulting instrument proves challenging to align in practice, unstable over time, and sometimes too slow for analyzing certain biological processes. This manuscript presents the coupling of the VIPA spectrograph to the microscope using a multimode fiber. As three-dimensional cellular assemblies represent the most realistic models of in vivo cell growth conditions, we choose to apply the resulting instrument to the study these samples. This choice prompts us to opt for spatial resolutions much higher than the incident light’s wavelength, allowing us to leverage the compromise between confocality and brightness to optimize the instrument. The manuscript therefore introduces a novel approach to the VIPA spectrometer that addresses the following three aspects : simplifying optical alignment, enhancing device stability, increasing measurement speed. By exploring these aspects, we present a strategy that optimizes the VIPA spectrometer’s performance in studying 3D multicellular assemblies, thus facilitating the study of these biological samples through Brillouin microspectroscopy. The system resulting from this approach will be experimentally used to monitor the morphogenesis of hollow cell assemblies, both qualitatively by tracking the formation of the empty space inside the assembly and quantitatively by studying the mechanical properties of the cells surrounding the cavity.