Criblage, identification et caractérisation biochimique, moléculaire et structurale de lipases, phospholipases et protéases d’origine microbienne et d’intérêt industriel

Screening, identification and biochemical, molecular and structural characterisation of microbial lipases, phospholipases and proteases of industrial interest

• Auteur / Autrice : Ahlem Dab
• Direction : Abdelkarim Abousalham, Bassem Jaouadi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie, biochimie et biotechnologie
• Date : Soutenance le 29/09/2023
• Etablissement(s) : Lyon 1 en cotutelle avec Université de Sfax (Tunisie)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (Villeurbanne, Rhône)
• Jury : Président / Présidente : Adriana-Erica Miele
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Abdelkarim Abousalham, Bassem Jaouadi, Sofiane Bezzine, Liliane Berti-Dupuis, Loubna Firdaous, Ahmed Aloulou, Annick Méjean
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sofiane Bezzine, Liliane Berti-Dupuis

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bio-industries

Applications industrielles

Biochimie

Protéases

Lipases

Mots clés libres

Phospholipase

Galactolipase

F. annulatum

Caractérisation

Expression hétérologue

Modélisation

Régiosépecificité

Lipase

Phospholipase

Lipase

Galactolipase

F. annulatum

Characterization

Heterologous expression

Modeling

Regiospecificity

Résumé

Cette étude présente une nouvelle enzyme lipolytique de la famille des (phospho)lipases, produite par la souche fongique Fusarium annulatum Bugnicourt nouvellement isolée. L'enzyme purifiée présente une activité spécifique élevée à la fois sur les triglycérides (3500 U/mg sur TC8) et sur les phospholipides (5000 U/mg sur le PC de jaune d'œuf). Une fois caractérisée, cette lipase, nommée FAL, a démontré une activité élevée sur une large gamme de pH et à des températures relativement élevées, ainsi qu'une stabilité alcaline significative, ce qui est rare chez les lipases fongiques. De plus, cette lipase alcaline semble être une candidate parfaite pour une application dans la détergence puisqu'elle a montré une remarquable stabilité en présence de tensioactifs non ioniques, d'agents oxydants, de produits de blanchiment et de divers détergents liquides et solides. Dans le cadre de cette étude, un gène codant pour une autre lipase de Fusarium annulatum a été cloné dans Pichia pastoris et purifié en une quantité importante (210 mg L-1). L'enzyme purifiée a également montré une activité spécifique élevée envers les triglycérides (6000 U/mg sur TC8) et les phospholipides (6500 U/mg sur le PC de jaune d'œuf). Les résultats du dichroïsme circulaire ont également révélé que la lipase recombinante (rFAL) maintient une bonne stabilité à des températures élevées, à des pH alcalins et en présence de solvants polaires. Les expériences de docking moléculaire in silico ont révélé que les triglycérides et les phospholipides s'ajustent bien dans le site actif de rFAL, avec une orientation favorisant la régiospécificité sn-1, en accord avec les expériences in vitro. Nos analyses structurales démontrent le rôle crucial du C-terminal dans l'expression de l'activité phospholipase de cette enzyme.

This study presents a new lipolytic enzyme from the (phospho)lipase family, produced by the newly isolated fungal strain Fusarium annulatum Bugnicourt. The purified enzyme exhibits a high specific activity on both triglycerides (3500 U/mg on TC8) and phospholipids (5000 U/mg on egg yolk PC). Once characterized, this lipase, named FAL, demonstrated high activity over a wide pH range and at relatively high temperatures, as well as significant alkaline stability, which is rare among fungal lipases. Furthermore, this alkaline lipase appears to be a perfect candidate for detergent applications, as it has shown remarkable stability in the presence of non-ionic surfactants, oxidizing agents, bleaching products, and various liquid and solid detergents. A gene encoding another lipase from Fusarium annulatum was successfully cloned into Pichia pastoris and purified in a significant quantity (210 mg L-1). The purified enzyme also exhibited high specific activity towards triglycerides (6000 U/mg on TC8) and phospholipids (6500 U/mg on egg yolk PC). Circular dichroism results revealed that the recombinant lipase (rFAL) maintains good stability at high temperatures, alkaline pH, and in the presence of polar solvents. Molecular docking experiments in silico demonstrated a favorable binding of triglycerides and phospholipids to the active site of rFAL, with an orientation that favors sn-1 regiospecificity, consistent with in vitro experiments. Our structural analyses demonstrate the crucial role of the C-terminal in the expression of phospholipase activity in this enzyme.