Evolution de la virulence et du spectre d’hôtes chez la bactérie pathogène émergente Legionella pneumophila

Evolution of virulence and host spectrum in the emergent bacterial pathogen Legionella pneumophila

• Auteur / Autrice : Guillaume Carrillo
• Direction : Vincent Daubin, Élisabeth Kay
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 29/09/2023
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Evolution Ecosystèmes Microbiologie Modélisation (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Biométrie et Biologie Evolutive
• Jury : Président / Présidente : Karen Moreau
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Vincent Daubin, Élisabeth Kay, Karen Moreau, Séverine Allegra, Lionel Guy, Ascel Régis Samba Louaka
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Séverine Allegra, Lionel Guy, Ascel Régis Samba Louaka

Mots clés

Mots clés contrôlés

Virulence (microbiologie)

Microbiologie

Legionella pneumophila

Bactéries pathogènes

Mots clés libres

Evolution

Microbiologie

Virulence

Evolution expérimentale

Evolution

Microbiology

Virulence

Experimental evolution

Résumé

Les bactéries du genre Legionella sont responsables chez l'homme d'une maladie appelée légionellose. Cette forme aiguë de pneumonie peut être mortelle dans 7 à 30% des cas, selon le statut immunologique du patient. Parmi plus de soixante espèces décrites à ce jour, le sérogroupe 1 de Legionella pneumophila est impliqué à lui seul dans 90% des cas de légionellose dans le monde. Cette surreprésentation clinique n'est pas liée à une prévalence accrue dans l'environnement. De plus, des études de génomique comparative n'ont pas permis d'identifier des gènes ou des fonctions spécifiquement présents dans les cinq sous-types les plus fréquemment associés à la maladie. Dans l'environnement, L. pneumophila colonise les écosystèmes aquatiques où elle est présente soit dans des biofilms mixtes, soit associée à des protozoaires hôtes (principalement des amibes) que la bactérie pénètre et utilise à son avantage pour se répliquer largement et finalement les tuer. Chez l'homme, la bactérie infecte les macrophages alvéolaires de la même manière que les amibes. L'élément clé de la virulence est le système de sécrétion Dot/Icm de type IV qui est utilisé pour manipuler l'hôte, en transloquant plus de 300 protéines bactériennes appelées effecteurs dans la cellule infectée. Plusieurs de ces effecteurs auraient été acquis par la bactérie par transfert horizontal de gènes au cours de sa coévolution avec ses hôtes protozoaires. Le vaste répertoire d'effecteurs ainsi que leur redondance fonctionnelle et la grande variabilité au sein des espèces sont autant de critères qui rendent extrêmement difficile la recherche d'un ensemble de gènes et de fonctionnalités expliquant la prévalence excessive de L. pneumophila dans les cas cliniques. Pour ce travail de thèse, nous avons utilisé deux expériences d'évolution expérimentale pour permettre à une souche clinique de L. pneumophila de réduire considérablement sa capacité infectieuse envers les amibes et de l'acquérir à nouveau dans un second temps. Le séquençage génomique réalisé en parallèle sur des spécimens à différents stades d'évolution nous a permis d'identifier le rôle d'un plasmide naturel (pLPP) dans la modification de la virulence de L. pneumophila. En effet, ce plasmide a la capacité de s'insérer dans le génome et de s'en exciser à l'aide d'une séquence d'insertion présente à la fois sur le plasmide et dans le génome. Ces événements d'insertion/excision sont directement liés à la diminution et à la ré-acquisition de la virulence, respectivement. Nous avons également réalisé des expériences d'infection sur différents types de cellules hôtes pour montrer que le schéma de diminution et de ré-acquisition de la virulence envers les amibes s'applique à d'autres hôtes, y compris les cellules humaines. Nous avons également commencé à caractériser un effecteur appelé SidH, dont les deux gènes transcrits sont situés de part et d'autre de la séquence d'insertion dans le génome de la bactérie. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle des événements de transfert horizontal de gènes seraient le principal moteur de l'émergence de L. pneumophila comme principale espèce pathogène du genre Legionella. Pour ce faire, nous avons mis en place une expérience visant à tester la capacité naturelle de transformation de L. norrlandica, la plus proche parente de L. pneumophila dans l'arbre évolutif, mais qui n’a jamais été retrouvée en clinique. Bien que L. norrlandica possède tous les gènes nécessaires à la transformation naturelle, nous n'avons pas réussi à la déclencher dans les conditions testées. Nous avons également montré que L. norrlandica peut se répliquer à l'intérieur des amibes, mais dans une moindre mesure que L. pneumophila. Dans l'ensemble, ces résultats montrent un nouveau mécanisme de régulation de la virulence chez L. pneumophila et ouvrent la voie à de futures recherches utilisant l'évolution expérimentale pour étudier l'émergence de bactéries pathogènes.

Bacteria from the genus Legionella are responsible in Human for a disease called Legionnaire's disease (LD) or legionellosis. This acute form of pneumonia can be fatal in 7 to 30% of cases, depending on the immunological status of the patient. Among more than sixty species described to this day, the serogroup 1 of Legionella pneumophila is alone implicated in 90% of LD cases worldwide. This clinical overrepresentation cannot be linked with an increased prevalence in the environment. What is more, recent comparative genomics studies were not successful in identifying genes or functions specifically present in the 5 more frequently disease-associated subtypes. In the environment, Legionella pneumophila colonizes aquatic ecosystems where it is present either in mixt biofilms or associated with protozoan hosts (mostly amoeba) that the bacteria will penetrate and utilize at its advantage to extensively replicate and ultimately kill. In humans, the bacteria infect alveolar macrophages in a fashion similar to that of amoeba infection. The key element of the virulence is the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS) that is used to manipulate the host, by translocating more than 300 bacterial proteins called effectors into the infected cell. Several of these effectors are thought to have been acquired by the bacteria through horizontal gene transfer during its lasting co-evolution with its protozoan hosts. The vast effector repertoire as well as their functional redundancy and the high variability within species are all criteria making extremely difficult to find a set of genes and functionality explaining the over prevalence of L. pneumophila in clinical cases. For this thesis work, we used two different setting of experimental evolution to allow a clinical strain of L. pneumophila to greatly lessen its infectious capacity towards amoeba and to reacquire it in a second time. Genomic sequencing was performed in parallel on specimens at different stages of evolution/re-evolution that allowed us to identify the role of a naturally occurring plasmid (pLPP) in the modification of the virulence in L. pneumophila. Indeed this plasmid has the ability to insert into the genome and excise from it using an insertion sequence present both on the plasmid and in the genome. These insertion/excision events are directly linked to the diminution and reacquisition of the virulence, respectively. We also performed infection experiment on different type of host cells to show that the pattern of diminution and reacquisition of virulence towards amoeba can be applied to other hosts as well, including human cells. We also began the characterisation of an effector protein called SidH, whose two transcribed genes are located at each side of the insertion sequence in the genome of the bacteria. In the second part of this work, we tested the hypothesis that events of horizontal gene transfer may have been the main drive for the emergence of L. pneumophila as the main pathogenic species of the Legionella genus. To do so, we set up an experiment to test the natural competence for transformation in L. norrlandica, the closest relative to L. pneumophila in the evolutionary tree, but unknown to cause legionellosis in human. Although L. norrlandica possessed all required genes for natural transformation to occur, we weren't successful in triggering it in the tested conditions. We also showed that L. norrlandica can replicate inside amoebae, although to a lesser extent that L. pneumophila. Taken together, these results show a new mechanism to regulate virulence in L. pneumophila and pave the way for future research using experimental evolution to study the emergence of pathogenic bacteria.