Étude de la structure et de l'interaction des protéines de la famille MEG et de leur rôle dans l'apparition de la fibrose hépatique

Structural and interaction study of MEG family proteins and their role in liver fibrosis onset

• Auteur / Autrice : Štěpánka Nedvědová
• Direction : Maggy Hologne, Matyáš Orsák, Adriana-Erica Miele
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 22/09/2023
• Etablissement(s) : Lyon 1 en cotutelle avec Česká zemědělská univerzita v Praze (Prague)
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale de Chimie (Lyon)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Sciences Analytiques
• Jury : Président / Présidente : Pavel Tlustoš
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Maggy Hologne, Sonia Longhi, Christina Sizun, Jaroslav Havlik, Petr Maršík, Saïda Mebarek Azzam, Frédéric Vellieux
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sonia Longhi, Christina Sizun

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dichroïsme circulaire

Protéines intrinsèquement désordonnées

Exons

Génétique

Schistosoma mansoni

Mots clés libres

Schistosoma mansoni

Gène micro-exon

RMN

Protéines intrinsèquement désordonnées

Dichroïsme circulaire

MEG

Schistosoma mansoni

Micro-exon genes

NMR

Intrinsically disordered proteins

Circular dichroism

MEG

Résumé

Les protéines MEG sont propres aux trématodes parasites, en particulier Schistosoma mansoni. Ces protéines sont codées par des gènes à micro-exons, qui ont une structure unique composée de micro-exons courts alternants avec de longs introns. Le séquençage du génome de S. mansoni a permis d'identifier 35 gènes codant 87 protéines MEG vérifiées. Ces gènes ne présentent aucune similitude avec d'autres gènes annotés, à l'exception de ceux que l'on trouve chez Schistosoma spp. Ils ne présentent pas de motifs ou de domaines fonctionnels identifiables. Les MEG subissent un épissage alternatif, ce qui entraîne la production de plusieurs isoformes à partir d'un seul ARNm. La plupart des familles de MEG comptent plusieurs membres, chacun ayant plusieurs isoformes épissées, ce qui permet à S. mansoni de produire une variété de protéines en fonction de l'environnement interne de l'hôte. Des études transcriptomiques ont suggéré que les protéines MEG sont impliquées dans les interactions hôte-parasite, en particulier dans la pénétration des œufs à travers la paroi intestinale. Ces protéines présentent une structure unique avec un peptide signal à l'extrémité N-terminale, ce qui indique qu'elles sont sécrétées. Les MEGs contiennent souvent un nombre important de cystéine et sont modélisées avec une structure protéique désordonnée (IDP). Malgré la nature intrigante des protéines MEG, peu d'études ont été menées sur leurs propriétés biophysiques. La thèse vise donc à combler cette lacune en se concentrant sur un trio de protéines MEG - MEG 2.1, MEG 3.2 et MEG 6 - qui ont été identifiées dans les œufs de S. mansoni. Pour étudier les MEGs, différents systèmes d'expression ont été testés afin d'obtenir des protéines recombinantes pour des analyses structurales. Malgré des efforts considérables, aucune des trois MEGs n'a pu être obtenue en quantité suffisante pour être analysée par RMN. La protéine MEG 6 n'a pas été exprimée du tout. L'isoforme 1 de la MEG 2.1 s'est révélée instable dans le système d'expression S2. L'isoforme 1 de MEG 3.2 a été exprimée avec succès en utilisant un protocole pour l'expression de protéines toxiques dans un système bactérien, mais la concentration requise de protéines marquées et non marquées pour l'analyse RMN n'a pas pu être atteinte. En outre, l'isoforme 1 de la MEG 3.2 a présenté des problèmes de stabilité. Compte tenu des difficultés liées à l'expression des protéines recombinantes, une stratégie de "division et reconstruction" a été employée. Des peptides courts issus des isoformes 1, 2 et 3 de la MEG 2.1 ont été synthétisés chimiquement. Ces peptides présentent des problèmes de solubilité dans les tampons et les solvants biologiquement pertinents. Pour résoudre ce problème, le DMSO-d6 à 100 % a été utilisé pour les mesures RMN, tandis que l'acétonitrile (également mélangé avec TFE) a été utilisé comme solvant pour les analyses de CD. Des expériences RMN ont été réalisées sur les peptides synthétisés à l'aide de techniques homonucléaires et hétéronucléaires. Les spectres RMN ont été enregistrés sur des peptides en abondance naturelle, ce qui a entraîné de longs temps d'analyse. Des calculs structuraux ont ensuite été effectués à l'aide du logiciel CYANA. L'isoforme 1 reconstruite et minimisée de MEG 2.1 a montré la formation d'hélices courtes et longues pendant les simulations de dynamique moléculaire. En outre, une analyse phylogénétique, une classification basée sur la structure primaire et des prédictions structurales ab initio ont été réalisées. Grâce à une combinaison d'analyses biochimiques, biophysiques et bioinformatiques, cette thèse visait à caractériser les protéines MEG sécrétées dans l'œuf. MEG 2.1 reste la seule famille de MEG pour laquelle toutes les variantes d'épissage ont été décrites structuralement. Cette thèse contribue à la compréhension de la diversité des protéines MEG et fournit une base pour de futures recherches sur leur importance fonctionnelle dans les interactions hôte-parasite.

MEG proteins are unique to parasitic trematodes, particularly Schistosoma mansoni. These proteins are encoded by micro-exon genes, which have a unique structure consisting of short micro-exons alternated by long introns. Through genome sequencing of S. mansoni, 35 genes encoding 87 verified MEG proteins were identified. These genes show no similarity to other annotated genes except those found in Schistosoma spp. Furthermore, they lack identifiable motifs or functional domains. MEGs undergo alternative splicing, resulting in the generation of multiple isoforms from a single mRNA. Most MEG families have several members, each with several spliced isoforms, enabling S. mansoni to produce a diverse range of proteins based on the internal environment of the human host. Transcriptomic studies have suggested that MEG proteins are involved in host-parasite interactions, particularly in the penetration of eggs through the intestinal wall. These proteins exhibit a unique structure with a signal peptide at the N-terminus, indicating their secretion. Additionally, MEG proteins often contain a significant amount of cysteine residues and are predicted to have a disordered protein structure (IDP). Despite the intriguing nature of MEG proteins, there have been limited studies investigating their biophysical properties. Only a few publications have focused on transcriptomic and localization analyses, with even fewer dedicated to their structural and functional characterization. Therefore, the current dissertation aims to address this knowledge gap by focusing on a trio of MEG proteins—MEG 2.1, MEG 3.2, and MEG 6—that have been identified in S. mansoni eggs. To study the MEG proteins, various expression systems, and conditions were tested to obtain recombinant proteins for structural analyses. Unfortunately, despite extensive efforts, none of the three MEG proteins were obtained in sufficient quantities for NMR analysis. MEG 6 protein was not expressed at all, while MEG 2.1 isoform 1 showed instability in the selected expression system. MEG 3.2 isoform 1 was successfully expressed using a specific protocol for toxic protein expression in a bacterial system, but the required concentration of both unlabeled and labeled protein for NMR analysis could not be achieved. Additionally, MEG 3.2 isoform 1 exhibited stability issues. Given the challenges in recombinant protein expression, a "divide and reconstruct" strategy was employed. Short peptides derived from isoforms 1, 2, and 3 of MEG 2.1 were chemically synthesized. However, these peptides posed solubility issues in biologically relevant buffers and organic solvents. To overcome this, 100% deuterated dimethyl sulphoxide (DMSO-d6) was used for NMR measurements, while acetonitrile (also mixed with trifluoroethanol) (TFE) were tested as suitable solvents for circular dichroism (CD) analyses. NMR experiments were performed on the synthesized peptides using homonuclear and heteronuclear techniques. The peptides were measured at natural abundance, resulting in lengthy analysis times. Subsequently, structural calculations using CYANA software were conducted. The reconstructed and minimized isoform 1 of MEG 2.1 exhibited the formation of short and long helices during molecular dynamics simulations. Additionally, phylogenetic analysis, classification based on primary structure, and ab initio structural predictions were performed. Through a combination of biochemical, biophysical, and bioinformatic analyses, this dissertation aimed to characterize the poorly studied egg-secreted MEG proteins. Notably, MEG 2.1 remains the only MEG family for which all splice variants have been structurally described. Overall, this study contributes to the understanding of MEG protein diversity and provides a foundation for future investigations into their functional significance in host-parasite interactions.