Hétérogénéité des neutrophiles et leurs écosystèmes dans l’immunosurveillance au cours de la tumorigenèse

Neutrophil heterogeneity and their ecosystems in immune surveillance across tumorigenesis

• Auteur / Autrice : Manuela Pereira Abrantes
• Direction : Marie-Cécile Michallet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie et Oncologie
• Date : Soutenance le 21/09/2023
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon
• Jury : Président / Présidente : Mathias Faure
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Etienne Meylan, Catherine Paul, Friederike Jönsson, Thomas Walter
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Etienne Meylan, Catherine Paul

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cancer -- Surveillance active

Transcriptome

Facteurs de croissance

Cancer colorectal

Neutrophiles

Mots clés libres

Neutrophiles

Transcriptomique

Immunosurveillance précoce

Cancer colorectal

Cancer du sein

Neutrophils

Transcriptomics

Early immune surveillance

Colorectal cancer

Breast cancer

Résumé

Le neutrophile est la cellule immunitaire la plus représentée dans le sang chez l’Homme, dont la migration au site inflammatoire est rapide. Le rôle du neutrophile a largement été décrit dans des contextes infectieux, auto-immunitaires et allergiques mais reste controversé dans le cancer, notamment dans les mécanismes d’immunosurveillance précoce. Le neutrophile se révèle être une population hétérogène tant phénotypiquement que fonctionnellement. L’origine et la compréhension de l’hétérogénéité des neutrophiles est un sujet émergent et croissant, mais aucune étude à ce jour ne décrit l’évolution de l’hétérogénéité des neutrophiles à différents stades. L’objectif de ma thèse est de caractériser cette hétérogénéité au sein des tissus au cours de la tumorigenèse, à partir de deux modèles d’études. Mon premier projet s’est intéressé au cancer colorectal (CCR) chez l’Homme de par l’accès privilégié à des échantillons de tissus adjacents colorectaux (AT), de tissus prénéoplasiques (polypes, P) et d'adénocarcinomes (ADK), frais, synchrones et pairés à partir de patients subissant des colectomies partielles ou totales. Des quantifications protéomiques démontrent que les neutrophiles représentent la principale augmentation de cellules immunitaires innées au sein de l'ADK. Pour la première fois, les profils transcriptomiques de neutrophiles triés et de leurs partenaires cellulaires par RNA-seq et single cell RNA-seq (scRNA-seq) au cours de la tumorigenèse ont été établis et intégrées pour déchiffrer l'hétérogénéité, l’évolution et les interactions cellulaires clés des neutrophiles, au cours du CCR. Alors que le microenvironnement du P et de l’ADK sont similaires et distinct de l’AT, le transcriptome des neutrophiles de P et d’AT sont corrélés mais différents de ceux de l’ADK. Ces résultats suggèrent une niche pré-inflammatoire dans le P favorable aux modifications des neutrophiles, précédant l'inflammation cancéreuse, favorisant la migration et l’activation des cellules myéloïdes. Les neutrophiles du P présentent des propriétés fonctionnelles (e.g. dégranulation, activation, production de cytokines) tandis que les neutrophiles de l'ADK présentent un état “d’épuisement” associé à un profil plutôt pro-tumoral (i.e. perte de fonctions canoniques et profil pro-tumoral). Le scRNA-seq de neutrophiles triés identifie 8 clusters distincts, dont deux sont spécifiquement enrichis dans l’AT et l’ADK. Le cluster enrichi dans l’AT est associé à des signatures anti-tumorales tandis que le cluster associé à l'ADK démontre des caractéristiques pro-tumorales, basées sur des analyses d’enrichissement de signatures issues de données publiques. Les analyses de trajectoire démontrent un continuum de l’AT, à P et ADK avec 3 trajectoires distinctes, où un cluster unique de neutrophiles exprimant des gènes induits par les interférons et enrichi dans l’ADK se distingue des autres. Le second projet s’est basé sur un modèle murin de carcinogenèse mammaire spontanée MMTV-NeuT pour lequel, à la différence du modèle chez l’Homme, nous avons accès aux différents stades tumoraux mais également au sang et aux organes lymphoïdes primaire (moelle osseuse) et secondaire (rate). Les analyses transcriptomiques de neutrophiles triés révèlent des états phénotypiques et fonctionnels distincts selon l’organe et le stade tumoral analysé. De manière originale, nous avons mis en évidence l’existence de neutrophiles EpCAM+ uniques aux tissus tumoraux et constituant 60 à 90% des neutrophiles totaux au cours de la tumorigenèse. L’expression d’EpCAM n’est pas endogène mais semblerait provenir de fragments membranaires exogènes à la surface du neutrophile, suggérant un mécanisme de trogocytose voire de trogoptose des cellules prénéoplasiques et tumorales. De futures études fonctionnelles permettront d’élucider le mécanisme et le rôle des neutrophiles EpCAM+.

The neutrophil is the most abundant immune cell in the human blood that migrates rapidly to the inflammatory site. The role of neutrophils has been extensively described in infectious, autoimmune, and allergic contexts, but it remains controversial in cancer, particularly in early immune surveillance mechanisms. Neutrophils are a heterogeneous population, both phenotypically and functionally. The origin and understanding of neutrophil heterogeneity are emerging and increasingly studied, albeit to date, no study has described the evolution of neutrophil heterogeneity at different stages. The aim of my thesis is to characterize this heterogeneity within tissues during tumorigenesis, using two models. My first project focused on colorectal cancer (CRC) in humans, taking advantage of a privileged access to fresh, synchronous, and paired adjacent colorectal tissue samples (AT), preneoplastic tissues (polyps, P), and adenocarcinomas (ADK), from patients undergoing partial or total colectomies. Proteomic quantification demonstrated that neutrophils represent the main increase in the innate immune compartment within ADK. For the first time, transcriptomic profiles of FACS-sorted neutrophils and their cellular partners using RNA-seq and single-cell RNA-seq (scRNA-seq) throughout tumorigenesis were established and integrated to decipher the heterogeneity, evolution, and key cellular interactions of neutrophils in CRC. While the microenvironment of P and ADK were similar and distinct from AT, the transcriptome of P and AT neutrophils were correlated but different from ADK-associated neutrophils. These results suggest a pre-inflammatory niche in P that favors neutrophil modifications, preceding cancer-related inflammation, promoting migration and activation of myeloid cells. P-associated neutrophils exhibited functional properties (e.g. degranulation, activation, cytokine production), while ADK-associated neutrophils showed an ''exhausted'' state associated with a more pro-tumoral profile (i.e. loss of canonical functions and pro-tumoral profile). scRNA-seq of FACS-sorted neutrophils identified 8 distinct clusters, two of which were specifically enriched in AT and ADK. The AT-enriched cluster was associated with anti-tumoral signatures, while the ADK-enriched cluster demonstrated pro-tumoral characteristics, based on enrichment analyses of publicly available data signatures. Trajectory analyses showed a continuum from AT to P and ADK with three distinct trajectories, where a unique ADK-enriched cluster of neutrophils expressing interferon-stimulated genes stood out from the others. The second project was based on a mouse model of spontaneous mammary carcinogenesis, MMTV-NeuT, for which, unlike the human model, we have access to breast tissues at different stages as well as blood and primary (bone marrow) and secondary (spleen) lymphoid organs. Transcriptomic analysis of FACS-sorted neutrophils revealed distinct phenotypic and functional states depending on the organ and tumor stage. Interestingly, we unveiled the existence of a unique EpCAM+ neutrophil population in tumor tissues, representing 60 to 90% of total neutrophils throughout tumorigenesis. EpCAM expression was not endogenous but seemed to originate from exogenous membrane fragments on the surface of neutrophils, suggesting a mechanism of trogocytosis or even trogoptosis of preneoplastic and tumor cells. Further functional studies will elucidate the mechanism and the role of EpCAM+ neutrophils.