Caractérisation structurale et fonctionnelle du transporteur de multiples drogues, BmrA par cryo-EM : création d’outils pour les études biophysiques et biochimiques des protéines membranaires

Structural and functional characterization of a multidrug transporter, BmrA, by cryoEM : creation of tools for biophysical and biochemical studies of membrane proteins

• Auteur / Autrice : Alexia Gobet
• Direction : Pierre Falson, Vincent Chaptal
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 12/07/2023
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Molecular Microbiology and Structural Biochemistry (Lyon ; 1999-....)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Broutin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre Falson, Vincent Chaptal, Isabelle Broutin, Valérie Biou, Hugues Nury, Lionel Ballut, Stéphane Bressanelli
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Valérie Biou, Hugues Nury

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microdomaines membranaires

Protéines membranaires

Résistance aux antibiotiques

Cryomicroscopie

Mots clés libres

BmrA

Cryo-EM

3DVA

Protéines membranaires

Détergents

Transporteur ABC

ABC transporter

BmrA

Cryo-EM

3DVA

Membrane protein

Detergents

Résumé

Depuis leur découverte, les antibiotiques ont été utilisés de façon massive et parfois non appropriée en médecine humaine mais également en agriculture. Face à l'action de ces médicaments visant à éliminer les bactéries, ces dernières ont développé différents mécanismes d'antibiorésistance s'opposant à cette action. Parmi les mécanismes développés par les bactéries pour lutter contre les antibiotiques, on retrouve la capacité à exporter le médicament hors de la cellule à travers la membrane plasmique. Cet export engendre une concentration de l'agent cytotoxique inférieure à son seuil de cytotoxicité, protégeant ainsi la cellule. Ceci est réalisé par les pompes d'efflux dont font partie les transporteurs ABC (ATP-binding cassette) qui effluent le substrat grâce à l'énergie fournie par la fixation et l'hydrolyse d'ATP. Le mécanisme mis en jeu lors de l'export de l'allocrite reste encore débattu au sein de la communauté scientifique. La protéine membranaire, BmrA, est un exportateur ABC présent chez Bacillus subtilis, actif sous forme homodimérique et capable de prendre en charge différents substrats. Au cours de ma thèse, j'ai cherché à améliorer la compréhension de son mécanisme, et plus particulièrement celle du passage d'un comportement michaélien à allostérique vis-à-vis de l'ATP-Mg2+en réponse à la fixation d'un substrat. Ainsi, j'ai résolu la structure de plusieurs intermédiaires conformationnels par cryomicroscopie électronique et étudié la plasticité de la protéine par analyse de la variabilité 3D. En parallèle, j'ai réalisé différents travaux méthodologiques contribuant à améliorer l'étude des protéines membranaires, de l'étape de l'expression à celle de l'étude structurale par cryo-EM.

Since their discovery, antibiotics have been massively used, and sometimes in non-appropriate ways in medicine, but also in agriculture. Due to these reasons, bacteria have developed different mechanisms to resist to antibiotic molecules, among these mechanisms, the capacity to expel these drugs outside the cell. This drug efflux lowers the effective concentration of the cytotoxic agent, hence negatively affecting its biological activity. Drug transport is carried on by efflux pumps, and among these pumps, ABC (ATP-binding cassette) transporters are able to transport drugs by harvesting the energy provided by ATP hydrolysis. However, despite the progress made in understanding the underlying mechanism of ABC transporters, some aspects of it remain unclear. BmrA is an ABC exporter of the bacterium Bacillus subtilis, active as a dimer and capable of transporting different classes of substrates. During my thesis, my aim was to elucidate the mechanism of function of BmrA, especially on how the binding of a substrate alters the nature of ATP-Mg2+ binding, from a Michaeliaen mode to an allosteric one. To do this, I solved the structures of different conformational intermediaries of the protein using Cryo-EM and studied BmrA plasticity by 3D variability analysis. Furthermore, I participated in the development of different methodical tools, aiming to help on the work on membrane proteins, from their expression to their cryo-EM study.