Identification et caractérisation de nouveaux gènes impliqués dans l’assemblage du cil

Identification and characterization of novel genes involved in cilium assembly

• Auteur / Autrice : Alison Carret
• Direction : Bénédicte Durand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 10/03/2023
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Mécanismes en science de la vie intégrative (Lyon ; 2022-....)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Louis Bessereau
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mélanie Bonhivers, Krzysztof Rogowski, Philippe Bastin, Nathalie Delgehyr
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Mélanie Bonhivers, Krzysztof Rogowski

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spermatogenèse

Mitochondries

Cils (cytologie)

Cycle cellulaire

Mots clés libres

Ciliogénese

Flagelle

Mip

Cycle cellulaire

Mitochondrie

Zone de transition

Spermatogénese

Ciliogenesis

Spermatogenesis

Flagella

Mip

Cell cycle

Mitochondria

Transition zone

Résumé

Les cils sont des structures microtubulaires conservées chez les eucaryotes. Ce sont de petites organelles ayant des fonctions cellulaires et physiologiques majeures dans de nombreux systèmes biologiques. Ainsi, chez l’humain, des dysfonctionnements ciliaires sont à l’origine d’une variété de maladies multi-systémiques, regroupées sous le terme ciliopathies. Le cil est constitué d’un axonème qui protrude du centriole/corps basal. Entre les deux se situe la zone de transition, une structure hautement organisée de la base du cil. Elle est mise en place lors de l’ancrage du corps basal à la membrane plasmique au cours de l’initiation de la ciliogenèse. Malgré l’identification de plusieurs modules protéiques requis lors des étapes initiales de la ciliogenèse, notre compréhension des mécanismes moléculaires régissant l’assemblage du cil reste incomplète. Dans ce contexte, mon projet de thèse a été d’identifier et de caractériser de nouveaux acteurs requis lors de la ciliogenèse. J’ai développé un crible génétique unique chez la drosophile qui m’a permis d’identifier plus d’une centaine de protéines. Ces travaux m’ont permis de révéler un couplage moléculaire de l’entrée en méiose et de la régulation de la croissance du cil. De plus, j’ai montré que les fonctions mitochondriales sont nécessaires aux étapes précoces de la ciliogenèse. Conjointement à l’étude des mécanismes moléculaires nouvellement révélés par le crible génétique, j’ai caractérisé les protéines ciliaires de la famille FAM166. Ces protéines ont été précédemment identifiées chez les mammifères, mais leur rôle n’a pas encore été révélé. En effet, notre équipe a identifié FAM166B comme un gène cible de RFX2 et RFX3, deux facteurs de transcription nécessaires à la ciliogenèse des cils motiles chez la souris. Les protéines de la famille FAM166 ont été identifiées comme des protéines internes des microtubules (MIPs) dans les cils motiles bovins et un variant de FAM166B est associé au grave syndrome de Meckel, une ciliopathie létale. Chez la drosophile, CG18335 et CG18336 (que nous appelons Fam166b et Fam166a, respectivement) possèdent le domaine DUF2475 caractéristique des protéines de la famille FAM166. J’ai montré que les deux protéines sont exprimées dans les cellules germinales mâles. Fam166a et Fam166b sont présents le long de l'axonème en fin de ciliogenèse et au corps basal à des stades plus précoces, avec des domaines de distribution distincts. Les mâles des drosophiles mutantes fam166a1 présentent des défauts de spermiogenèse et une hypofertilité, tandis que les mâles fam166b1 ne semblent pas avoir de baisse de fertilité. Ainsi, les deux protéines ne partagent pas de rôles redondants ou synergiques apparents dans les cellules germinales mâles. Mes résultats identifient Fam166a et Fam166b comme des protéines ciliaires ayant des fonctions distinctes dans la maturation des spermatozoïdes. Nous proposons que Fam166a soit potentiellement une nouvelle MIP, requise pendant l'élongation des flagelles et la maturation des spermatozoïdes chez la drosophile. Ainsi, au cours de ma thèse, j’ai identifié de nouveaux acteurs cruciaux pour l’initiation de la ciliogenèse et l’élongation du cil. Ceci ouvre de nouvelles voies de compréhension des processus d’assemblage du cil.

Cilia are little highly conserved microtubular organelles among eukaryotes species. They play major functions in a multitude of biological systems. Thus, in human, defects in ciliogenesis or ciliary function can be at the origin of various and multi-systemic pathologies, grouped under the term ciliopathies. The cilium (or flagellum) consists of an axoneme that protrudes from the centriole/basal body (BB). Between these two structures is the transition zone, a highly organized structure at the base of the cilium, that is assembled while the BB anchors to the plasma membrane during the initiation of ciliogenesis. Despite the identification of several protein modules required during the initial steps of ciliogenesis, our understanding of the molecular mechanisms involved in cilium assembly remains incomplete. In this context, my thesis project was to identify and characterize new actors required during ciliogenesis. I developed a unique genetic screen in Drosophila that allowed me to identify more than a hundred proteins. Also, this work revealed a molecular coupling of meiosis entry and regulation of cilium growth. Furthermore, I showed that functional mitochondria are required for the early stages of ciliogenesis. In addition to studying the molecular mechanisms newly revealed by the genetic screen, I characterized ciliary proteins of the FAM166 family, which functions have not yet been revealed. Our team identified FAM166B as a target gene for RFX2 and RFX3, two transcription factors required for motile ciliogenesis, in mice. FAM166 family proteins have been identified as microtubule-internal proteins (MIPs) in bovine motile cilia and a specific variant of human FAM166B is associated with severe Meckel syndrome, a lethal ciliopathy in utero. In Drosophila, CG18335 and CG18336 (which we call Fam166b and Fam166a, respectively) share the DUF2475 domain characteristic of the FAM166 family of proteins. I have shown that both are expressed in male germ cells. Fam166a and Fam166b are recruited along the axoneme at late stage of flagella elongation and at the basal body at earlier stages, with distinct expression patterns. Drosophila fam166a1 male mutants exhibit defects in spermiogenesis and hypofertility, whereas fam166b1 males do not appear to have reduced fertility. Thus, the two proteins do not share any apparent redundant or synergistic roles in male germ cells. My results identify Fam166a and Fam166b as ciliary proteins with distinct and non-overlapping functions in sperm maturation. We propose that Fam166a is a potential novel MIP required during flagella elongation and spermatozoon maturation in flies. Thus, in the course of my thesis, I identified new cellular actors crucial for the initiation of ciliogenesis and cilium elongation. This work provides novel understandings of cilium assembly processes.