Thèse soutenue

Monooxygénations catalysées par des polycétide synthases modulaires : caractérisation structurale et fonctionnelle

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Auteur / Autrice : Romain Francois
Direction : Kira Weissman
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
Date : Soutenance le 22/11/2023
Etablissement(s) : Université de Lorraine
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale BioSE - Biologie, Santé, Environnement
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Ingénierie moléculaire et physiopathologie articulaire (Vandœuvre-lès-Nancy)
Jury : Président / Présidente : Benoît Guillot
Examinateurs / Examinatrices : Kira Weissman, Coralie Bompard, Christophe Corre, Sylvie Lautru, Arnaud Gruez
Rapporteurs / Rapporteuses : Coralie Bompard, Christophe Corre

Résumé

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Les polycétides sont des métabolites spécialisés synthétisés par une grande variété d’organismes incluant les bactéries, les champignons, les végétaux ou encore certains animaux. Bien que leurs fonctions écologiques demeurent souvent mystérieuses, leurs activités biologiques leur permettent d'être exploitées comme médicaments chez l'homme et l'animal (antibiotiques, anthelmintiques, anticancéreux, etc.). Si, dans certains cas, les molécules naturelles peuvent être utilisées, dans d'autres, il est nécessaire d'adapter les structures des métabolites pour optimiser leurs propriétés médicinales. Une stratégie prometteuse pour obtenir de telles molécules consiste à modifier les enzymes polykétides synthases (PKS) par génie génétique. Cependant, cette approche nécessite une connaissance détaillée du fonctionnement de ces enzymes au niveau moléculaire. Les PKS sont des systèmes complexes de haut poids moléculaire divisés en plusieurs polypeptides appelés sous-unités, eux-mêmes composés de modules, chacun catalysant un cycle d'extension et de modification des polykétides. Les activités de ces modules sont divisées en domaines, chacun ayant un rôle biosynthétique défini.La découverte de nouvelles fonctions enzymatiques portées par ces domaines élargit la gamme connue des réactions catalysées par les PKS et, par conséquent, la diversité chimique des polykétides synthétisés. En principe, ces activités peuvent ensuite être incorporées dans d'autres PKS, conduisant à la synthèse de dérivés de polykétides aux propriétés potentiellement améliorées. Plusieurs réactions non canoniques intéressantes ont été récemment identifiées dans les PKS synthétisant l'oocydine et le lobatamide A, catalysées par diverses activités monooxygénases. Plus précisément, trois types de monooxygénases ont été identifiés : les monooxygénases de type Baeyer-Villiger (BVMO), les -hydroxylases et les monooxygénases génératrices d'oxime (Ox).Afin d'étayer les efforts visant à exploiter cette chimie dans l'ingénierie, le travail décrit dans cette thèse visait à établir des relations structure-fonction détaillées pour ces enzymes. Le principal accomplissement de ce doctorat a été de caractériser en détail le domaine Ox de la PKS de la lobatamide en utilisant une approche combinant la cristallographie aux rayons X et la mutagénèse dirigée, couplée à la spectrométrie de masse. Sa structure tridimensionnelle a été élucidée à haute résolution et les acides aminés impliqués dans la catalyse enzymatique ont été identifiés, ce qui nous a permis de proposer un mécanisme catalytique. De plus, des expériences de docking in silico et de mutagenèse ont fourni des informations supplémentaires sur l'ordre des événements biosynthétiques au sein du module et sur son agencement spatiale au cours de la catalyse. Les résultats de cette partie du travail ont été publiés dans la revue à fort impact Angew. Chemie en tant qu'article complet.Des études bioinformatiques préliminaires, suivies de la production et de la purification des BVMO et de l’-hydroxylase, nous ont permis d’initier les premiers essais de cristallisation de ces enzymes, dans le but de résoudre leurs structures et d'établir les bases structurales de ces activités monooxygénases. Ces tentatives n'ont pas été couronnées de succès, mais des expériences supplémentaires sont proposées.