Spécificités des cellules stromales isolées des deux couches du tissu adipeux sous-cutané : rôles de leur sécrétion sur l'angiogenèse et la neurogenèse

Specific features of stromal cells isolated from both layers of subcutaneous adipose tissue : roles of their secretion on angiogenesis and neurogenesis

• Auteur / Autrice : Jérôme Laloze
• Direction : Alexis Desmoulière
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Chimie Santé mention Physiologie et physiopathologie
• Date : Soutenance le 23/11/2023
• Etablissement(s) : Limoges
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Ω-LIM-Biologie-Chimie-Santé (Limoges ; 2022-)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : NEURopathies et Innovations Thérapeutiques (Limoges)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Jacques Lataillade
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Benoît Chaput, Audrey Varin, Joël Brie, Amandine Rovini
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Jean-Jacques Lataillade, Barbara Hersant

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cicatrisation

Antiangiogéniques

Innervation

Exosomes

Tissu adipeux

Mots clés libres

AD-MSCs

Tissu adipeux

Exosomes

Innervation

Angiogénèse

Cicatrisation cutanée

AD-MSCs

Adipose tissu

Exosomes

Innervation

Angiogenesis

Skin repair

Résumé

Ces dernières années, les cellules stromales mésenchymateuses ont suscité un engouement au sein de la communauté scientifique dans le domaine de la régénération tissulaire, grâce à leurs propriétés trophiques et immunomodulatrices. Plus particulièrement, les cellules souches mésenchymateuses issues du tissu adipeux (AD-MSCs) sont de plus en plus utilisées en chirurgie plastique mais aussi en recherche fondamentale et clinique. Elles ont un impact par exemple sur la survie du lipofilling, sur le traitement des douleurs neuropatiques après incisions chirurgicales, sur les problèmes d’ischémie-reperfusion… Malgré la diversité des approches d’ingénierie tissulaire et les recherches sur les substituts cutanés, la prise en charge des plaies chroniques reste un défi majeur de santé publique. La littérature récente montre que les effets de ces cellules sont liés principalement à leur sécrétion paracrine : dans le surnageant de culture ou via les exosomes. Le tissu adipeux abdominal sous-cutané (AAT) est divisé en deux couches : la couche superficielle (sAAT) et la couche profonde (dAAT). Cependant, il n'est pas certain que chaque couche présente des caractéristiques similaires et pertinentes en termes de potentiel régénérateur des AD-MSCs. Le premier axe du travail a été de comparer les caractéristiques des AD-MSCs (obtenues par digestion enzymatique du TA d’abdominoplasties) par cytométrie en flux, par essai de prolifération et de différenciation en cellules mésodermiques. Une comparaison de leurs propriétés immunosuppressives a également été réalisée. Après une revue de la littérature exhaustive sur les AD-MSCs, nous avons voulu comparer les effets de ces cellules et de leurs produits de sécrétion sur leur capacités angiogéniques et neurostimulatrices. Nous avons commencé par comparer le profil sécrétoire des AD-MSCs par Proteom Profiller®. A la suite de ces résultats, nous nous sommes intéressés aux effets du sécrétome complet et des exosomes sur la migration des cellules endothéliales puis la formation de réseaux vasculaires, du côté angiogénique, et sur la repousse axonale après blessure ainsi que la croissance neuritique d’un point de vue neuromodulation. Tout d’abord, nos résultats montrent qu’il existe bien une différence entre les deux couches du TA, notamment sur la prolifération des AD-MSCs en faveur du sAAT et sur la différenciation adipogénique en faveur du dAAT. L'analyse phénotypique de la fraction stromale vasculaire a révélé que la couche superficielle était plus pure avec moins de cellules hématopoiétiques et plus d’AD-MSCs. Ensuite, l’analyse des caractéristiques des exosomes obtenus par ultracentrifugation différentielle n’a pas montré de différences significatives entre les deux couches. L’analyse du contenu cytokinique du surnageant complet et des exosomes n’a détecté aucune différence également. En ce qui concerne l’angiogénèse, nous nous sommes rendus compte que le sécrétome était délétère par rapport au contrôle quant à la formation d’un réseau vasculaire et à la migration des cellules endothéliales. Les exosomes avaient un effet pro-angiogénique mineur mais cependant plus importants que le sécrétome complet. En ce qui concerne la neuritogznèse, les exosomes possèdaient des effets encore une fois plus intéressants que le sécrétome. De plus, les exosomes des AD-MSCs issues du dAAT étaient significativement plus intéressants que ceux des AD-MSCs issues du sAAT pour la croissance neuritique uniquement. Ainsi, ils semblent plus efficaces sur la neuromodulation, alors que les exosomes d’aucune couche n'ont d'impact significatif sur la fonction endothéliale. Dans tous les cas, les exosomes possèdent des propriétés plus importantes que le sécrétome complet. En conclusion, des différences parfois significatives ont été mises en évidence entre les deux couches et entre les produits de sécrétion ce qui laisse entrevoir des perspectives cliniques différentes en fonction de la couche prélevée.

In recent years, mesenchymal stromal cells have become a hot topic in the scientific community in the field of tissue regeneration, thanks to their trophic and immunomodulatory properties. In particular, adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells (AD-MSCs) are increasingly used in plastic surgery, as well as in basic and clinical research. Despite the diversity of tissue engineering approaches and research into skin substitutes, the management of chronic wounds remains a major public health challenge. Recent literature shows that the effects of these cells are mainly linked to their paracrine secretion: in the culture supernatant or via exosomes. Subcutaneous abdominal adipose tissue (AAT) is divided into two layers: the superficial layer (sAAT) and the deep layer (dAAT). However, it is not clear whether each layer has similar characteristics relevant to the regenerative potential of AD-MSCs. The first line of work was to compare the characteristics of AD-MSCs (obtained by enzymatic digestion of abdominoplasty) by flow cytometry, proliferation assay and differentiation assay into mesodermal cells. A comparison of their immunosuppressive properties was also carried out. Following an exhaustive literature review on AD-MSCs, we set out to compare the effects of these cells and their secretory products on their angiogenic and neurostimulatory capacities. We began by comparing the secretory profile of AD-MSCs using Proteom Profiller®. Following these results, we turned our attention to the effects of the complete secretome and exosomes on endothelial cell migration and vascular network formation, from the angiogenic point of view, and on axonal regrowth after injury and neuritic growth from a neuromodulatory point of view. First, our results show that there is indeed a difference between the two layers of the AT, notably on AD-MSCs proliferation in favor of sAAT and on adipogenic differentiation in favor of dAAT. Phenotypic analysis of the vascular stromal fraction revealed that the superficial layer was more pure, with fewer hematopoietic cells and more AD-MSCs. Next, analysis of exosome characteristics obtained by differential ultracentrifugation showed no significant differences between the two layers. Analysis of the cytokine content of the complete supernatant and exosomes detected no differences either. With regard to angiogenesis, we found that the secretome was deleterious to vascular network formation and endothelial cell migration compared with the control. Exosomes had minor pro-angiogenic effects, but therefore more important than the complete secretome. With regard to neuritogenesis, exosomes again had more interesting effects than the secretome. Moreover, exosomes obtained from dAAT-derived AD-MSCs were significantly more interesting than those obtained from sAAT-derived AD-MSCs for neuritic growth alone. Thus, they appear to be more effective on neuromodulation, whereas no exosomes of the two layer have any significant impact on endothelial function. In all cases, exosomes possess more important properties than the complete secretome. In conclusion, some-significant differences between the two layers and between the secretion products were highlighted, suggesting different clinical prospects depending on the layer harvested.