Hydroxyapatites dopées au cuivre ou au silicium : analyse du comportement de cellules endothéliales in vitro

Copper- or silicon-doped hydroxyapatites : in vitro analysis of endothelial cell behavior

• Auteur / Autrice : Arthur Brunel
• Direction : Éric Champion, Amandine Magnaudeix
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Matériaux céramiques et traitements de surface
• Date : Soutenance le 11/09/2023
• Etablissement(s) : Limoges
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences et Ingénierie (Limoges ; 2022-)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Recherche sur les CERamiques
• Jury : Président / Présidente : Fabrice Lalloué
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : David Marchat
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Joëlle Amédée Vilamitjana, Delphine Logeart

Mots clés

Mots clés contrôlés

Matériaux céramiques

Cellules endothéliales

Cultures cellulaires

Mots clés libres

Céramiques phosphocalciques

Substitution ionique (Silicium. Cuivre)

Angiogenèse

Phosphocalcic ceramics

Ionic substitution (Silicon. Copper)

Cell culture

Endothelial cells

Angiogenesis

Résumé

Les lacunes osseuses de grande taille, survenant en raison d’un traumatisme ou d’une condition pathologique, nécessitent l’utilisation d’un implant, naturel ou synthétique pour obtenir une réparation satisfaisante de l’os. De l’os naturel n’est pas toujours disponible ou son prélèvement n’est pas toujours désirable. Les solutions synthétiques couramment utilisées incluent des céramiques phosphocalciques dont fait partie l’hydroxyapatite de formule Ca10(PO4)6(OH)2. Cette céramique aisée à mettre en forme et biocompatible n’est cependant pas stimulatrice de l’angiogenèse. En raison du manque de vascularisation, les implants poreux en hydroxyapatite ne permettent pas une réparation osseuse satisfaisante pour les défauts de grande taille. De nombreuses études ont été effectuées sur l’incorporation d’éléments chimiques susceptibles d’induire un effet stimulateur de la néoformation tissulaire au sein de l’hydroxyapatite. Les travaux de cette thèse ont porté sur la caractérisation d’hydroxyapatites dopées, élaborées précédemment au laboratoire IRCER. Celles-ci sont de l’hydroxyapatite dopée au silicium (Si0.4HA) de formule Ca10(PO4)5.6(SiO4)0.4(OH)1.6, et deux hydroxyapatites dopées au cuivre de formule Ca10(PO4)6CuIIzCuIyO2H2-2z-y (y ≫ z) où x=y+z et x = 0,1 (Cu0.1HA) ou x = 0,5 (Cu0.5HA). Ces hydroxyapatites dopées, ainsi que l’hydroxyapatite pure servant de référence, ont été mises en forme en tant que pastilles céramiques denses, et caractérisées physico-chimiquement pour pouvoir les comparer dans une série d’expériences biologiques visant à évaluer leurs propriétés angiogéniques et angioconductrices. Ces expériences utilisent les cellules endothéliales murines C166 cultivées jusqu’à 7 jours et démontrent la biocompatibilité des matériaux Si0.4HA et Cu0.1HA. Le matériau Cu0.5HA est cytotoxique à 7 jours en raison de sa plus forte teneur en cuivre. Les matériaux Cu0.1HA et Cu0.5HA possèdent un effet pro-angiogénique dépendant du cuivre. Le matériau Si0.4HA possèderait un faible effet pro-angiogénique par le biais de silicium en solution. Les modèles de culture statique couramment utilisés pour caractériser les biomatériaux ne répliquent toutefois pas avec justesse les conditions in vivo du site d’implantation. Cette limite peut compromettre la représentativité des caractérisations in vitro. Pour améliorer la pertinence des caractérisations biologiques in vitro préalables à des tests in vivo, une partie des travaux de cette thèse a été dédiée à la mise en place d’un modèle de culture in vitro en condition dynamique. Des architectures macroporeuses d’hydroxyapatite ont été mise en forme par micro-extrusion, caractérisées physico-chimiquement, et ensemencées avec des monocultures de C166, de pré-ostéoblastes murins MC3T3-E1 sous-clone 14 ou des cocultures au ratio de deux C166 pour une MC3T3-E1 sous-clone 14. Ces architectures ont été cultivées jusqu’à 3 semaines dans un système de bioréacteur en flux par perfusion. Les caractérisations biologiques issues d’essais préliminaires montrent la présence de cellules se développant activement au sein des architectures et mettent en évidence l’importance de cocultures.

Large bone defects that occur due to trauma or disease require the use of an implant, either natural or synthetic, for proper bone repair. Natural bone autograft is not always available or its harvest desirable. Synthetic implants that are commonly used include phosphocalcic ceramics such as hydroxyapatite of formula Ca10(PO4)6(OH)2. However, this easily processed and biocompatible ceramic does not stimulate angiogenesis. Due to the lack of vascularization, hydroxyapatite implants do not allow satisfactory bone repair for large defects. Numerous studies have been performed on the incorporation of chemical elements to stimulate bone healing within hydroxyapatite scaffolds. This thesis’ work was carried out on doped hydroxyapatites previously elaborated at the IRCER laboratory (Institute of Research for Ceramics) of Limoges. These are a silicon-doped hydroxyapatite (Si0.4HA) of formula Ca10(PO4)5.6(SiO4)0.4(OH)1.6, and two copper-doped hydroxyapatites of formulas Ca10(PO4)6CuIIzCuIyO2H2-2z-y (y ≫ z) where x=y+z and x = 0.1 (Cu0.1HA) or x = 0.5 (Cu0.5HA). During this thesis, these ceramics, and pure hydroxyapatite used as a reference, were shaped as pellets and physico-chemically characterized in order to compare them in a series of biological experiments aiming to evaluate their angiogenic and angioconductive properties. These experiments used murine C166 endothelial cells for up to 7 days of culture and demonstrate the biocompatibility of the Si0.4HA and Cu0.1HA ceramic materials. The Cu0.5HA material is cytotoxic at 7 days of culture due to its high copper content. The Cu0.1HA and Cu0.5HA materials have a copper-dependent pro-angiogenic effect. The Si0.4HA material may have a weak pro-angiogenic effect through silicon in solution. Static culture models are commonly used to characterize the biological behavior of biomaterials but do not accurately replicate the implantation site in vivo conditions. This shortcoming can compromise the representativeness of in vitro characterizations. To improve the relevance of in vitro biological characterizations prior to in vivo tests, a part of this thesis’ work was dedicated to the implementation of an in vitro culture model in dynamic condition. Macroporous hydroxyapatite architectures were shaped by micro-extrusion and physiochemically characterized. They were seeded with monocultures of C166, murine MC3T3-E1 subclone 14 pre-osteoblasts, or cocultures with the ratio of two C166 to one MC3T3-E1 subclone 14. These architectures were grown for up to 3 weeks in a perfusion flow bioreactor system. Preliminary biological characterizations show the presence of actively growing cells within the architectures and point out the importance of co-cultures.