Au-delà de la fermentation ABE : ingénierie métabolique de Clostridium acetobutylicum pour la production de métabolites alternatifs

Beyond ABE fermentation : metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for the production of alternative metabolites

• Auteur / Autrice : Paul Jacottin
• Direction : Philippe Soucaille, Tom Wilding-Steele
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
• Date : Soutenance le 29/09/2023
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering - Toulouse Biotechnology Institute / TBI
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Meynial
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Wolfgang Liebl
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Henri-Pierre Fierobe, Luis Bañeras Vives

Mots clés

Mots clés contrôlés

Fermentation acétonobutylique

Lactate

Acides aminés

Ingénierie métabolique

Clostridium acetobutylicum

Mots clés libres

Clostridium acetobutylicum

Ingénierie métabolique

Acides aminés

Lactate

Clostridium acetobutylicum

Metabolic Engineering

Amino Acids

Lactate

Résumé

Clostridium acetobutylicum est utilisé en biotechnologie industrielle depuis un siècle grâce sa capacité à produire de l'acétone et du butanol à partir de nombreux carbohydrates. Notre équipe a récemment démontré que des modifications spécifiques du génome de C. acetobutylicum lui permettent de dégrader efficacement des substrats lignocellulosiques, ce qui en fait un candidat prometteur de bioprocédé consolidé. Cette thèse décrit des stratégies d'ingénierie métabolique pour obtenir des mutants de C. acetobutylicum produisant des produits d'intérêt industriel.Tout d'abord, un outil CRISPR/Cas9 a été utilisé pour supprimer les gènes ptb-buk, ldhA et thlA, afin d'obtenir un mutant dont tous les éléments clés pour l'oxydation du NAD(P)H sont codés par le mégaplasmide pSOL1. Cette souche plateforme a ensuite été utilisée pour insérer les voies NADH-dépendantes de composés que C. acetobutylicum ne produit normalement qu'en petites quantités.L'insertion d'un plasmide codant pour ldhA dans cette souche plateforme, suivie de la perte de pSOL1, a donné un mutant ∆ptb-buk, ∆ldhA, ∆thlA, ∆pSOL1, pforGly441Leu produisant uniquement du lactate à partir du glucose. Cette souche homolactique a ensuite été modifiée en inactivant les gènes hydA et pta codant respectivement pour l'hydrogénase principale et la phosphotransacétylase. Le séquençage génomique complet du mutant a confirmé que l'inactivation de certains gènes clés du métabolisme central suffit à convertir le conventionnel métabolisme biphasique de C. acetobutylicum en un métabolisme homofermentaire.La souche plateforme a ensuite été utilisée pour sélectionner une mutation clé améliorant considérablement la production de X de C. acetobutylicum. Nous avons démontré que la surexpression des gènes CACxxxx et CACxxxx permet à Escherichia coli et C. acetobutylicum de produire du X. Un mutant ∆ptb-buk, ∆ldhA, ∆thlA, ∆pSOL1 avec la région CACxxxx-CACxxxx dupliquée a pu produire 28 g/L de X et 16 g/L d'acétate à partir de 60 g/L de glucose en trois jours, représentant les meilleurs rendement, productivité et titre obtenus pour un procédé anaérobie. Ensuite, la réinsertion d'une voie acétone (thlA3 de Clostridium kluyveri, ctfAB-adc de Clostridium beijerinckii) à la place de hbd a permis une conversion partielle de l'acétate en acétone. De plus, la transformation d'un plasmide codant pour la voie du X au Y de Z a permis la production d'un mélange d'acétate, de X et de Y à partir de glucose. À notre connaissance, il s'agit du seul exemple de production anaérobie de Y à partir de glucose. L’amélioration des voies de l'acétone et/ou du Y permettrait d’obtenir des souches industriellement pertinentes.Enfin, C. acetobutylicum a été modifié pour améliorer les voies de l'éthanol et de deux acides aminés. La transformation d'un plasmide codant pour une pyruvate décarboxylase et une alcool déshydrogénase dans la souche plateforme ∆ptb-buk, ∆ldhA, ∆thlA a augmenté le rendement en éthanol jusqu'à 80% de la valeur théorique, ouvrant la voie à l'ingénierie d'une souche capable de produire uniquement de l'éthanol. La transformation d'un plasmide exprimant le gène d’une acide aminé déshydrogénase et le gène d'un exporteur d'acide aminé dans la même souche plateforme a permis de produire jusqu'à 7 g/L d’acide aminé avec un rendement de 0,5 g/g.

The strict anaerobe Clostridium acetobutylicum has a century-long history with industrial biotechnology due to its ability to produce acetone and butanol from a wide range of carbohydrates. Our team has recently demonstrated that C. acetobutylicum can also efficiently degrade lignocellulosic substrates thanks to specific genome editions, making it a promising candidate for consolidated bioprocessing. This thesis describes metabolic engineering strategies to obtain C. acetobutylicum mutants producing fermentation products of industrial relevance.First, a CRISPR/Cas9 tool was used to delete the genes ptb-buk, ldhA and thlA which resulted in a mutant encoding the remaining key elements for NAD(P)H oxidation on the megaplasmid pSOL1. This platform strain was then further used to insert the NADH oxidation pathways of compounds that C. acetobutylicum normally only produces in small amounts.The insertion of a plasmid encoding ldhA into this platform strain, followed by the loss of pSOL1, resulted in a ∆ptb-buk, ∆ldhA, ∆thlA, ∆pSOL1, pforGly441Leu mutant that only produces lactic acid from glucose. This homolactic C. acetobutylicum strain was further modified with the disruption of the genes hydA and pta encoding the main hydrogenase and the phosphotransacetylase, respectively. The whole genome sequencing of the mutant confirms that the knockout of some key central metabolism genes is sufficient to convert the conventional biphasic metabolism of C. acetobutylicum to a homofermentative one.The platform strain was then used to select a key mutation that considerably improved the X producing ability of C. acetobutylicum. We demonstrated that the overexpression of the uncharacterised genes CACxxxx and CACxxxx enables X production in Escherichia coli and C. acetobutylicum. A ∆ptb-buk, ∆ldhA, ∆thlA, ∆pSOL1 mutant with the CACxxxx-CACxxxx region duplicated was able to produce up to 28 g/L of X and 16 g/L of acetate from 60 g/L of glucose in three days which represents the bests yield, productivity and titre achieved for an anaerobic process. Then, the re-insertion of an acetone pathway (thlA3 gene from Clostridium kluyveri, ctfAB-adc genes from Clostridium beijerinckii) in place of hbd allowed a partial conversion of acetate to acetone. Furthermore, the transformation of a plasmid encoding the X to Y pathway of Z allowed the production of an acetate, X and Y mixture from glucose. To our knowledge, this is the only described example of an anaerobic Y production from glucose in a single-step fermentation. Further improvements in either the acetone and/or Y pathways could result in industrially relevant strains.Finally, C. acetobutylicum was engineered to improve ethanol, and two amino acids pathways. The transformation of a plasmid coding for a pyruvate decarboxylase and an alcohol dehydrogenase into the ∆ptb-buk, ∆ldhA, ∆thlA platform strain increased ethanol yield up to 80% of the theoretical value, paving the way to engineer a strain able to only produce ethanol. While the transformation of a plasmid expressing an amino acid dehydrogenase gene and an amino acid exporter gene into the same platform strain allowed amino acid production up to 7 g/L reaching yields of 0.5 g/g.