Implication de eIF2 dans la réponse des cardiomyocytes au stress du réticulum endoplasmique

Involvement of eIF2 in cardiomyocytes response to endoplasmic reticulum stress

• Auteur / Autrice : Cristina Cardenal Peralta
• Direction : Emmanuelle Schmitt, Jérôme Fagart
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 15/09/2023
• Etablissement(s) : Institut polytechnique de Paris
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de l'Institut polytechnique de Paris
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Biologie Structurale de la Cellule (Palaiseau ; 1975-....) - Laboratoire de Biologie Structurale de la Cellule / BIOC
• Jury : Président / Présidente : Franck Martin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Emmanuelle Schmitt, Christophe Romier, Magali Blaud, Etienne Dubiez
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christophe Romier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Acétylation

Réticulum endoplasmique

Cardiomyocytes

Mots clés libres

Eif2

Cardiomyocytes

Réticulum endoplasmique

Stress

Eif2

Cardiomyocytes

Endoplasmic reticulum

Stress

Résumé

Au cours de la dernière décennie, le stress du réticulum endoplasmique (RE) est apparu comme un mécanisme important dans le développement des maladies cardiaques, notamment l'ischémie, la cardiomyopathie dilatée et l'insuffisance cardiaque. Le stress du RE déclenche la réponse aux protéines non repliées (UPR) initiée par la phosphorylation de la sous-unité alpha du facteur d'initiation eucaryote 2 (eIF2). On considère qu'une induction légère à modérée du stress du RE déclenche une réponse réparatrice basée sur l'autophagie, tandis qu'un stress du RE sévère ou chronique favorise une réponse apoptotique qui contribue au développement de la maladie cardiaque. Par conséquent, la thérapie cardiaque basée sur la modulation du stress ER apparaît comme une nouvelle approche prometteuse pour promouvoir des adaptations bénéfiques et éviter l'apoptose.Nos collaborateurs de l'INSERM ont montré que la sirtuine 1 (SIRT1), une lysine désacétylase dépendante du NAD+, protège les cardiomyocytes de l'apoptose induite par le stress du RE en atténuant spécifiquement l'activation de la voie de phosphorylation eIF2α et en promouvant l'autophagie. Ils ont également identifié l'acétylation de deux lysines de l'eIF2α, K141 et K143, et ont démontré que SIRT1 désacétylait ces lysines pour protéger le cœur d'un stress ER sévère.Aucune information n'est disponible sur les conséquences de l'acétylation de l'eIF2α sur son organisation structurale et sa fonction. L'objectif de ce projet de doctorat est de déchiffrer les bases moléculaires et structurelles de l'interaction SIRT1:eIF2α. Au cours de cette thèse, nous avons réussi à purifier une version acétylée de l'eIF2α en utilisant un système orthogonal dérivé du système de pyrrolysine des archées. Ce système permet d'introduire une acétyl-lysine à la place d'un codon STOP. Après une optimisation poussée, nous avons pu utiliser cette protéine pour tester l'activité catalytique de SIRT1 par western blotting. Nous avons également produit une version acétylée de la protéine qui portait une mutation S52D, imitant la phosphorylation, et nous avons également pu obtenir des taux catalytiques en utilisant cette version de la protéine.Nous avons également caractérisé l'activité catalytique de SIRT1 en utilisant des peptides imitant l'acétylation de 143 lysines dans l'eIF2α. L'utilisation de peptides dans la littérature est controversée car la plupart d'entre eux sont modifiés avec une partie hydrophobe qui peut affecter l'affinité de SIRT1 pour son substrat. Dans notre approche, nous utilisons des peptides non modifiés, plus proches du substrat natif.Au cours de cette thèse, nous avons pu obtenir une structure cristallographique d'un mimic de l'acétylation de l'eIF2α. Enfin, nous avons initié des essais de cristallisation avec les substrats SIRT1:peptide et SIRT1:eIF2α.

Over the last decade, endoplasmic reticulum (ER) stress has emerged as an important mechanism involved in the development of cardiac diseases including ischemia, dilated cardiomyopathy and heart failure. ER stress triggers the Unfolded Protein Response (UPR) initiated by the phosphorylation of the alpha subunit of the eukaryotic initiation factor 2 (eIF2). It is considered that a mild-to-moderate induction of ER stress triggers a restorative autophagy-based response whereas severe or chronic ER stress promotes an apoptotic response which contributes to the development of the cardiac disease. Therefore, cardiac therapy based on ER stress modulation is emerging as a promising new approach to promote beneficial adaptations and avoid apoptosis.Our INSERM's collaborator showed that sirtuin 1 (SIRT1), an NAD+-dependent lysine deacetylase, protects cardiomyocytes from ER stress-induced apoptosis by specifically attenuating activation of the eIF2α phosphorylation pathway and promoting autophagy. They also identified acetylation of two lysines of eIF2α, K141 and K143 and demonstrated that SIRT1 deacetylates these lysines to protect the heart from severe ER stress.No information is available on the consequences of eIF2α acetylation on its structural organization and its function. The aim of this PhD project is to decipher the molecular and structural basis of the SIRT1:eIF2α interaction. During this PhD, we were able to successfully purify an acetylated version eIF2α using an orthogonal system derived from the archaeal pyrrolysine system. Using this system, an acetyl-lysine was introduced on the place of a STOP codon. After extensive optimization, we were able to use this protein to test SIRT1 catalytic activity using western blotting. We also produced an acetylated version of the protein which carried an S52D mutation, mimicking phosphorylation, and were able to also obtain catalytic rates using this version of the protein.We also characterized SIRT1’s catalytic activity using mimic peptides of 143 lysine acetylation in eIF2α. The use of peptides in the literature is controversial because most of them are modified with a hydrophobic moiety that can affect SIRT1 affinity for its substrate. In our approach, we use non-modified peptides, closer to the native substrate.During this thesis, we were able to obtain a crystallographic structure of a mimic of eIF2α acetylation. Finally, we initiated crystallization trials with SIRT1:peptide substrates and SIRT1:eIF2α.