Développement d'un dispositif médical pour la détection simultanée haute sensibilité de biomarqueurs sanguins pour la prise en charge terrain des patients en souffrance cardiaque

Point-of-Care medical device development for high sensitivity multiplexed detection of blood biomarkers for health care management of cardiac patients

• Auteur / Autrice : Mathilde Aubret
• Direction : Arnaud Buhot, Myriam Cubizolles
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique pour les sciences du vivant
• Date : Soutenance le 05/10/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale physique (Grenoble, Isère, France ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'électronique et de technologie de l'information (Grenoble ; 1967-....)
• Jury : Président / Présidente : Franz Brückert
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Emmanuel Delamarche, Corinne Ravelet
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Magalie Faivre, Franck Molina

Mots clés

Mots clés contrôlés

Maladies cardiovasculaires

Microfluidique

Aptamères

Multiplexage

Télécommunications

Mots clés libres

Multiplexage

Aptamères

Microfluidique

Point-Of-Care

Marqeurs cardiaques

Point-Of-Care

Microfluidic

Multiplex

Aptamers

Cardiac markers

Résumé

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de décès dans le monde, et plusieurs biomarqueurs sont utilisés pour diagnostiquer les patients en souffrance cardiaque. La troponine est le biomarqueur de référence pour l’infarctus du myocarde, et l’évaluation de la quantité de troponine dans le sang des patients est cruciale pour les décisions médicales. Les méthodes conventionnelles pour la détection de la troponine et d’autres marqueurs cardiaques sont souvent couteuses et longues, car elles nécessitent de passer par un laboratoire centralisé d’analyses médicales. Les appareils de biologie délocalisée permettent d’effectuer un test sanguin plus rapide au plus près du patient, mais manquent actuellement de sensibilité. Le but de cette thèse est de proposer une méthode terrain innovante pour quantifier les biomarqueurs cardiaques dans le sang et de l’intégrer dans une cartouche placée sur un instrument automatisé et transportable pour la détection haute sensibilité et rapide.Afin d’améliorer la sensibilité des tests de détection, nous développons une méthode basée sur l’amplification isotherme d’acides nucléiques grâce à une structure oligonucléotidique originale appelée « haltère ». L’échantillon liquide contenant la cible est incubé avec l’halètre qui intègre différents types de sondes moléculaires comme des anticorps ou des aptamères. Ces protocoles de détection complets sont déclinés pour diverses cibles et intégrés sur une plateforme autonome et portable. Cette plateforme comprend des cartouches microfluidiques comportant un réseau de chambres fluidiques permettant de gérer des volumes discrets de fluides. L’architecture de la cartouche est conçue sur la base des protocoles développés et permet d’effectuer chaque étape, depuis le prélèvement sanguin jusqu’au résultat.Nous avons validé l’amplification isotherme (LAMP) de la séquence haltère intégrant divers types de sondes moléculaires et étudié divers paramètres influant sur l’amplification isotherme pour une meilleure compréhension du processus. Nous avons utilisé la thrombine comme protéine modèle et avons inclus un aptamère spécifique dans la structure haltère. La méthode de détection ainsi développée, nommée aptameroLAMP, est sensible (100 pM) et s’affranchit totalement de l’utilisation d’anticorps. L’application de cette méthode étant limiée à la disponibilité d’un couple d’aptamères, pour le biomarqueur cardiaque troponine, nous avons décliné la méthode avec des anticorps couplés à la structure haltère pour son amplification isotherme. Cette méthode nommée immunoLAMP a été testée avec des plasmas sanguins humains et permet d’atteindre une limite de détection de 100 pg/mL, pertinente pour des dosages physio-pathologiques. Chaque étape de ce protocole de détection complexe a été intégrée dans des cartouches microfluidiques dédiées pilotées par un automate portable. Deux architectures microfluidiques principales ont été développées. La première architecture permet de réaliser les étapes de préparation d’échantillon pour la capture de la cible sur des billes magnétiques. La troponine est détectée dans le plasma jusqu’à une concentration de 1 ng/mL. La seconde architecture propose l’intégration de l’étape LAMP. La cartouche microfluidique est placée sur un système d’actuation thermique, combiné à un système de détection optique pour le suivi de la fluorescence en temps réel. La quantification de l’haltère par amplification LAMP dans cette seconde architecture microfluidique est possible jusqu’à des concentrations de 10 pM.Cette méthode de détection utilisant la LAMP comme méthode de détection est générique et ouvre de nombreuses perspectives pour son application à d’autres biomarqueurs cardiaques (NTproBNP, miRNA…). La technologie microfluidique et l’instrument développé permettront in fine la détection multiplexe de divers biomarqueurs sur cette même plateforme, et devrait permettre l’amélioration du diagnostic des maladies cardiovasculaires.

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world and several biomarkers are clinically used to diagnose patients. Cardiac troponin is currently the gold standard for the diagnostic of acute myocardial infarction (AMI). In hospital emergency departments, testing patient blood for cardiac troponin is crucial to rule-in or rule-out patients. Conventional methods to detect cardiac troponin and other biomarkers are usually performed in central medical laboratories with costly equipment and long analysis time. Point-of-Care devices propose on-site and rapid testing, but these devices currently lack sensitivity. We propose an innovative quantification assay for cardiac biomarkers integrated into a portable and automated instrument for rapid and high sensitivity testing.We developed a method based on isothermal nucleic acids amplification (LAMP) using an original structure called dumbbell. For the quantification of biomarkers, the sample is incubated with this dumbbell structure containing various types of molecular probes such as aptamers or antibodies. Complete detection protocols are derived for various types of targets and integrated on a portable and automated platform. This latter contains microfluidic cartridges including a network of fluidic chambers used for the discrete manipulation of fluids. The cartridge architecture is designed specifically for the developed assay based on dumbbell amplification, and allow carrying out all the assay steps, from the sample recovery to the result.We validated the isothermal amplification of the dumbbell structure with various types of molecular probes. We studied different parameters influencing the amplification reaction for a better understanding of the amplification process. We used thrombin as a model protein and included a specific thrombin aptamer in the dumbbell structure to obtain sensitive (100 pM) and antibody-free detection using this aptameroLAMP method. It is however limited to targets for which a double aptamer sandwich is available. For the troponin cardiac biomarker, we derived the method with antibodies coupled with the dumbbell structure for its exponential amplification, named immunoLAMP. We tested this method on human plasma samples and reached a limit of detection of 100 pg/mL, a relevant concentration for physio-pathological testing. Then, each step of the detection assay was successfully integrated in microfluidic cartridges on a portable instrument. Two main architectures were designed. The first one allowed the sample preparation on magnetic beads to sandwich capture the target. Troponin was detected down to 1 ng/mL in this cartridge using the fully automated instrument. The second architecture proposes the LAMP reaction integration. The microfluidic cartridge is therefore placed on a thermal actuation system associated with an optical module to record the real-time fluorescence. The quantification of the dumbbell using LAMP in this second architecture was possible down to 10 pM.Our detection method using LAMP is generic and opens many perspectives for its application to other types of cardiac biomarkers (NTproBNP, miRNA…). The versatility of the microfluidic technology and the instrument developed should allow the multiplexed detection of cardiac biomarkers on this platform using this generic detection method, and should improve cardiovascular diseases diagnostic.