Analyse des facteurs régulant l'activité de l'isoforme PLA1-1 : une étude de réflectivité neutronique et de spectrométrie de masse

Analysis of the Factors Regulating the Activity of the PLA1-1 isoform : A Neutron Reflectivity and Mass-Spectrometric study

• Auteur / Autrice : Giacomo Corucci
• Direction : Giovanna Fragneto
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique appliquée
• Date : Soutenance le 13/03/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale physique (Grenoble, Isère, France ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Max von Laue-Paul Langevin (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Judith Peters
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Elisabetta Boeri Erba, Cyrille Botté, Robert Jacobs
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Yuri Gerelli, Frédéric Carrière

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectrométrie de masse

Rayons X -- Diffusion

Biologie moléculaire

Mots clés libres

Biophysique moléculaire

Expression et purification de lipides et de protéines

Diffusion de neutrons et de rayons x

Spectrometrie de masse

Lipid and Protein expression and purification

Molecular Biophysics

Neutron and x-Ray scattering

Mass spectrometry

Résumé

Les glycéro-phospholipides sont des molécules amphipathiques constituées d'une tête polaire et de chaines hydrophobes. Ces molécules sont impliquées dans plusieurs mechanismes cellulaires, et sont également fondamentales dans le confinement structurel des cellules et de leurs organelles. Pour que la membrane soit structurellement et chimiquement fonctionnelle, elle doit retenir sa fluidité en cas de changements survenus dans l'environnement. Ainsi, plusieurs pathways de le remodelage et la dégradation des phospholipides sont constamment engagés. Au sein de ceux-ci, les phospholipases (PLAs) jouent un rôle clé. Dans ce travail de thèse, une phospholipase du groupe A est prise en considération et sa cinétique complexe et son interaction avec les membranes lipidiques modèles sont analysés. Les phospholipases sont des enzymes lipolytiques qui hydrolysent les substrats phospholipidiques au niveau de liaisons ester spécifiques. Elles sont répandues dans la nature et jouent des rôles très divers depuis la transduction du signal et la production de médiator à l'homéostasie des phospholipides membranaires. Les phospholipases varient considérablement dans leur structure, leur fonction, leur régulation et leur mode d'action donc une compréhension plus profonde de leur dynamique et de leur cinétique peut être très crucial. L’étude présente consiste à employer la réflectivité neutronique et la spectrométrie de masse, mais aussi d'autres techniques physico-chimiques, pour mieux comprendre les principes qui sous-tendent la spécificité de substrat des phospholipases. Les réactions des PLAs se produisent en quelques étapes, les plus importantes étant corrélées à la spécificité de la PLA étudiée. Plus précisément, la propension à l'efflux et l'hébergement actif du site sont les deux goulots d'étranglement de la réaction, et à travers ces deux étapes le substrat préféré est sélectionné pour être clivé. La propension à l'efflux est la capacité d'un phospholipide molécule à sortir de la membrane où elle se trouve. Cette propriété est directement liée aux propriétés physiques de la molécule de phospholipide et de la membrane, telles que les interactions hydrophobes, qui jouent un rôle clé dans ce processus. Le deuxième goulot d'étranglement concerne l'hébergement du site actif, décrivant à quel point une molécule de phospholipide s'adapte dans la poche du site actif de la PLA. Ici, nous avons étudié en détail l'effet de la longueur de la chaîne acylique et de l'insaturation des phospholipides sur leur hydrolyse par le type PLA1-1 (provenant d'Aspergillus oryzae), afin d'évaluer comment le phospholipide préféré est sélectionné, en particulier si la première ou la deuxième étape est important dans ce processus. La PLA1-1 a été exprimée dans E. coli et purifiée sous sa forme pure. Les changements structurels de la membrane lipidique modèle ont également été analysés, y compris la manière dont ces changements affectent l'activité et l'évolution de la cinétique médiée par le PLA1-1 à l'examen. Les résultats obtenus montrent une nette préférence de la PLA1-1 pour les molécules phospholipidiques à forte propension à l'efflux, où un nombre plus court et plus élevé de chaînes acyles à doubles liaisons contenues dans les phospholipides semblent être celles qui sont clivées avec des taux élevés. De plus, une inhibition médiée par les acides gras libres libérés de la réaction d'hydrolyse semble se produire. Les changements structurels sur la membrane lors de la réaction d'hydrolyse se révèlent critiques dans certains cas pour la vitesse de la réaction. Les produits de l'hydrolyse des phospholipides forment une couche diluée sur le dessus de la membrane modèle à l'examen, plafonnant le profil de dégradation. Cette couche n'apparaît que lorsque la vitesse de réaction est inférieure à un certain niveau. L'activité lyso-PLA a été trouvée pour le PLA1-1, où après une certaine période au cours de la réaction, la deuxième chaîne acyle est également dégradée.

Glycero-phospholipids are amphipathic molecules constituted by a polar head and hydrophobic chains. These molecules are involved in several pathways, and are also fundamental in the structural containment of cells and their organelles. For the membrane to be structurally and chemically functional, its fluidity has to be retained upon changes occurring in the surroundings. Therefore, several pathways for the phospholipid remodelling and degradation are constantly engaged. Within those, phospholipases play a key role. In this thesis work, a phospholipase of the group A is taken into consideration and analysed in its complex kinetics and interaction with model lipid membranes. Phospholipases (PLAs) are lipolytic enzymes that hydrolyse phospholipid substrates at specific ester bonds. They are widespread in nature and play very diverse roles right from signal transduction and lipid mediator production to membrane phospholipid homeostasis. Phospholipases vary considerably in their structure, function, regulation, and mode of action therefore a deeper understanding of their dynamics and kinetics can be very crucial. The present study involves employing neutron reflectivity and mass spectrometry, including other physico-chemical techniques, to better understand the principles underlying the substrate specificity of phospholipases. PLA reactions occur in few steps, where the most important ones are correlated with the specificity of the PLA under examination. Specifically, efflux propensity and active site accommodation are the two bottlenecks of the reaction, and through these two steps the preferred substrate is selected in order to be cleaved. The efflux propensity is the ability of a phospholipid molecule to move out from the membrane where it lies. This property is related directly to the physical properties of the phospholipid molecule and the membrane, such as the hydrophobic interactions, that play a key role in this process. The second bottleneck regards the active site accommodation, describing how well a phospholipid molecule adapts itself into the active site pocket of the PLA. Here, we studied in detail the effect of acyl chain length and unsaturation of phospholipids on their hydrolysis by type PLA1-1 (sourced from Aspergillus oryzae), in order to assess how the preferred phospholipid is selected, specifically if the first or the second step is important in this process. The PLA1-1 was expressed in E. coli and purified in its pure form. Structural changes of the model lipid membrane were also analysed, including how these changes affect the activity and the course of the kinetics mediated by the PLA1-1 under examination.The results obtained show a clear preference of the PLA1-1 for the high efflux propensity phospholipid molecules, where shorter and higher number of double bonds acyl chains contained in phospholipids appear to be the ones cleaved with high rates. Additionally, an inhibition mediated by the free fatty acids released from the hydrolysis reaction seems to occur. Structural changes on the membrane upon the hydrolysis reaction, are found to be critical in some cases for the rate of the reaction. Products from the hydrolysis of the phospholipids form a diluted layer on the top of the model membrane under examination, plateauing the degradation profile. This layer appears only when the reaction rate is below a certain level. Lyso-PLA activity was found for the PLA1-1, where after a certain period during the reaction, also the second acyl chain is degraded.