Thèse soutenue

Les secrets obscurs des protéines fluorescentes : manipulation de la photophysique des fluorophores pour améliorer la SMLM quantitative

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Auteur / Autrice : Jip Wulffele
Direction : Dominique BourgeoisJoanna Timmins
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
Date : Soutenance le 21/11/2023
Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
Jury : Président / Présidente : Cécile Morlot
Examinateurs / Examinatrices : Antoine Delon, Juliette Griffie, Jérôme Dupuy
Rapporteurs / Rapporteuses : Christian Lesterlin, Mike Heilemann

Mots clés

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Mots clés contrôlés

Résumé

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La microscopie de localisation à molécule unique par fluorescence (SMLM) est devenue un outil indispensable en biologie structurale et cellulaire intégrée, permettant de mieux comprendre les organisations et dynamiques macromoléculaires à l'échelle nanométrique in cellulo. La microscopie de localisation photoactivée (PALM), qui repose sur le comportement photophysique "intelligent" des protéines fluorescentes phototransformables (PTFP), est une technique SMLM très répandue. Cependant, les comportements photophysiques complexes des PTFP entravent les applications quantitatives de la PALM, telles que le comptage (qPALM) et le suivi d'une seule particule (sptPALM). Outre les comportements suboptimaux des fluorophores, les artefacts d'imagerie et la nécessité d'une analyse sophistiquée des données contribuent à l'utilisation encore limitée des techniques PALM quantitatives. Dans le but d'étendre l'application de la technique PALM quantitative, mon travail de doctorat consiste en deux projets, qui traitent de différents aspects de la technique PALM quantitative.Le premier projet est axé sur la caractérisation des PTFP, dans le but de développer des stratégies visant à améliorer leur comportement pour SMLM. Ce travail commence par une comparaison entre différentes plateformes d'immobilisation des protéines pour la caractérisation photophysique des PTFP. Ensuite, nous étudions les effets de différentes conditions d'illumination sur le comportement du populaire FP photoconvertible vert-rouge mEos4b, en utilisant une combinaison de microscopie de fluorescence à molécule unique et d'ensemble, ainsi que des simulations. Enfin, ma thèse contribue au développement d'un nouveau modèle photophysique décrivant le comportement du FP réversiblement photoswitchable rsEGFP2 à température cryogénique. Dans l'ensemble, ce travail contribue à une meilleure compréhension du comportement photophysique des PTFPs et fournit des lignes directrices pour des schémas d'imagerie optimisés pour l'imagerie PALM.Le second projet concerne l'application de sptPALM pour étudier le remodelage des nucléoïdes induit par le stress chez Deinococcus radiodurans, l'une des bactéries les plus radiorésistantes connues à ce jour. En surveillant la dynamique de diffusion de la protéine HU associée au nucléoïde et marquée au mEos4b, ce travail révèle que le remodelage du nucléoïde se déroule différemment en réponse à différents stress. À l'aide de simulations, il montre comment la petite taille des bactéries complique l'interprétation des données sptPALM. Ce travail met en évidence la valeur de sptPALM pour l'étude des bactéries, mais identifie également les faiblesses des pipelines d'analyse actuels qui peuvent conduire à une interprétation erronée des données.