Imagerie in vivo des ESCRT-III sur les sites de bourgeonnement du VIH-1

In vivo imaging of ESCRT-III at HIV-1 budding sites

• Auteur / Autrice : Haiyan Wang
• Direction : Winfried Weissenhorn, Cécile Boscheron
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 28/11/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble, Isère, France ; 1992-....)
• Jury : Président / Présidente : Wim Burmeister
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Patricia Renesto
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Andrea Cimarelli, Clarisse Berlioz-Torrent

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biochimie

Mots clés libres

Escrt-Iii

Bourgeonnement

Microscope électronique

Budding

Electron microscopy

Escrt-Iii

Résumé

Le complexe de tri endosomal requis pour le transport-III (ESCRT-III) est une machinerie de remodelage membranaire ancienne et hautement conservée qui catalyse un large éventail de processus de remodelage membranaire cellulaire, y compris le bourgeonnement de virus enveloppés tels que le VIH-1. En raison de la résolution spatiale et de la nature transitoire de l'assemblage ESCRT-III in vivo, la compréhension de l'architecture du complexe ESCRT-III natif sur les sites de bourgeonnement du VIH-1 reste un défi.Dans cette thèse, nous avons développé un outil d'inhibition transitoire inductible par des médicaments afin d'améliorer la durée de vie du complexe ESCRT-III dans les sites de bourgeonnement du VIH-1. Nous avons généré des protéines de fusion CHMP4B, CHMP3 et CHMP2A avec la protéase NS3 du virus de l'hépatite C séparées par un linker contenant le site de clivage de la protéase, ce qui permet l'autoclavage lors de l'expression. Nous avons ensuite caractérisé les protéines de fusion CHMP-NS3 en l'absence et en présence de l'inhibiteur de protéase Glecaprevir en ce qui concerne l'expression, la stabilité, la localisation et la libération de VLP VIH-1 Gag.L'analyse par Western blotting a révélé une accumulation rapide et stable des protéines de fusion CHMP-NS3 avec un effet dominant négatif sur la libération des VLP Gag après traitement médicamenteux ; les protéines de fusion CHMP4B-NS3 et CHMP2A-NS3 ont réduit la libération des VLP, tandis que CHMP3-NS3 a exercé un effet mineur et a créé une synergie avec CHMP2A. Des études de localisation ont démontré la relocalisation des protéines de fusion CHMP-NS3 dominantes-négatives dans la membrane plasmique, les endosomes et les sites de bourgeonnement des VLP Gag. L'imagerie par microscopie électronique à transmission a confirmé l'altération de la libération des VLP en fonction du médicament, les VLP étant reliées à la membrane plasmique par des cols membranaires. En outre, l'altération de la libération des VLP lors de l'ajout du glécaprévir est caractérisée par une rétention prolongée des VLP à la membrane plasmique en présence de CHMP4B-NS3 et de CHMP2A-NS3.Dans l'ensemble, nos résultats donnent un aperçu des conséquences fonctionnelles de l'inhibition de la fission membranaire médiée par ESCRT-III pendant le bourgeonnement du VIH-1, et soulignent le potentiel d'un nouvel outil inductible par le médicament pour étudier l'architecture ESCRT native dans les sites de bourgeonnement du VIH-1 ou d'autres processus cellulaires catalysés par l'ESCRT.Nous avons également intégré cet outil dominant-négatif dans notre flux de travail de préparation d'échantillons cellulaires par cryo-microscopie électronique, dans le but de capturer le complexe ESCRT-III dans les sites de bourgeonnement du VIH-1. Cependant, en raison de la nature complexe de la cellule, des optimisations supplémentaires de la préparation des échantillons sont nécessaires.

The endosomal sorting complex required for transport-III (ESCRT-III) is an ancient and highly conserved membrane remodeling machinery that catalyzes a wide range of cellular membrane remodeling processes, including the budding of enveloped viruses such as HIV-1. Due to the spatial resolution and transient nature of ESCRT-III assembly in vivo, understanding the architecture of the native ESCRT-III complex at HIV-1 budding sites remains challenging.In this thesis, we developed a drug-inducible transient inhibitory tool to enhance the ESCRT-III lifetime at HIV-1 budding sites. We generated CHMP4B, CHMP3, and CHMP2A fusion proteins with the hepatitis C virus NS3 protease separated by a linker containing the protease cleavage site, which allows autocleavage upon expression. Then we characterized the CHMP-NS3 fusion proteins in the absence and presence of the protease inhibitor Glecaprevir with respect to expression, stability, localization and HIV-1 Gag VLP release.Western blotting analysis revealed rapid and stable accumulation of CHMP-NS3 fusion proteins with a dominant-negative effect on Gag VLP release upon drug treatment; CHMP4B-NS3 and CHMP2A-NS3 fusion proteins reduced VLP release, whereas CHMP3-NS3 exerted a minor effect and synergize with CHMP2A. Localization studies demonstrated the re-localization of dominant-negative CHMP-NS3 fusion proteins to the plasma membrane, endosomes and Gag VLP budding sites. Transmission electron microscopy imaging confirmed the drug-dependent impairment of VLP release with VLPs connected to the plasma membrane via membrane necks. In addition, the impairment of VLP release upon Glecaprevir addition is characterized by an extended retention of VLPs at the plasma membrane in the presence of CHMP4B-NS3 and CHMP2A-NS3.Overall, our findings provide insights into the functional consequences of inhibiting ESCRT-III-mediated membrane fission during HIV-1 budding, and highlight the potential of a novel drug-inducible tool for studying the native ESCRT architecture at HIV-1 budding sites or other ESCRT-catalyzed cellular processes.We also integrated this dominant-negative tool into our cryo-electron microscopy cell sample preparation workflow, aiming to capture the ESCRT-III complex at HIV-1 budding sites. However, due to the complex nature of the cell, additional sample preparation optimizations are required.