Etudes des voies de biosynthèse de l’ubiquinone chez les protéobactéries

Study of ubiquinone biosynthetic pathways in proteobacteria

• Auteur / Autrice : Katayoun Kazemzadeh Ferizhendi
• Direction : Ludovic Pelosi, Fabien Pierrel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie biologie
• Date : Soutenance le 03/11/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Techniques de l’ingénierie médicale et de la complexité - Informatique, mathématiques et applications (Grenoble, Isère, France)
• Jury : Président / Présidente : Christelle Breton
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Anne Walburger
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Laurent Aussel, Simonetta Gribaldo

Mots clés

Mots clés contrôlés

Pathogénicité

Protéobactéries

Anaérobiose

Ubiquinones

Mots clés libres

Ubiquinone

Aérobiose / Anaérobiose

Métabolisme respiratoire

Hydroxylases

Protéobactéries

Pathogénicité

Ubiquinone

Aerobiosis / Anaerobiosis

Respiratory metabolism

Hydroxylases

Proteobacteria

Pathogenicity

Résumé

L'ubiquinone (UQ) est un lipide redox qui intervient dans le transfert d'électrons et de protons dans les chaines respiratoires des eucaryotes et des protéobactéries. Il joue un rôle clé dans la bioénergétique de ces organismes et sa voie de biosynthèse a été largement étudiée chez Escherichia coli. Cette bactérie anaérobie facultative synthétise l’UQ en aérobie via une voie O2-dépendante et en anaérobie via une voie O2-indépendante. Ces deux voies multi-étapes font intervenir différentes enzymes et protéines accessoires. Certaines sont communes aux deux voies (UbiA à UbiE, UbiG et UbiX) alors que d’autres sont impliquées uniquement dans la voie O2-dépendante (UbiI, UbiH, UbiF, UbiJ et UbiK) ou dans la voie O2-indépendante (UbiT à UbiV). Chacune des deux voies comporte trois réactions d’hydroxylation sur des atomes de carbone contiguës du cycle aromatique des intermédiaires de l’UQ. Durant ces travaux de thèse, nous nous sommes intéressés aux réactions d’hydroxylation des deux voies chez les protéobactéries, d’un point de vue biochimique, évolutif et physiologique. D’autre part, nous avons également abordé le rôle de l’UQ dans la pathogénicité de la bactérie Francisella novicida. En conditions aérobies, les trois réactions d’hydroxylation sont catalysées par des monooxygénases à flavine (FMOs) ou à fer (Coq7) qui utilisent le dioxygène (O2) comme source de groupement hydroxyle. Il a été montré que diverses combinaisons d’hydroxylases étaient utilisées par les bactéries. Par exemple, E. coli utilise trois FMOs, (UbiI, H et F) alors que Rhodospirillum rubrum emploie UbiL (FMO) et Coq7, et que Neisseria meningitidis n’a qu’une seule enzyme, UbiM (FMO). Ces résultats ont suggéré une régiosélectivité (capacité à hydroxyler un carbone spécifique du cycle aromatique) variée pour les hydroxylases O2-dépendante, notamment pour les FMOs. Nous avons donc exploré l’évolution de la régiosélectivité des FMOs impliquées dans la biosynthèse de l’UQ (Ubi-FMOs) en analysant les génomes de 2352 espèces d’α-, β- et γ-protéobactéries. Nos analyses phylogénétiques et biochimiques ont mis en évidence l’existence d’une nouvelle FMO (UbiN) et ont révélé que les Ubi-FMOs se sont diversifiées via trois événements de duplication associés à un cas de sous-fonctionnalisation et à deux cas de néo-fonctionnalisation liés à une perte de Coq7. Par ailleurs, l’équipe a montré l’implication des protéines UbiT, U, V dans la voie O2-indépendante de biosynthèse de l’UQ. Cependant, l’identité des hydroxylases et du donneur de groupement hydroxyle pour les réactions d’hydroxylation O2-indépendantes restaient à élucider. Grâce à des expériences in vivo, nous avons montré que l’hétérodimère UbiU-V est capable d’hydroxyler les trois atomes de carbone des intermédiaires de l’UQ et que l’activité d’UbiU-V dépend d’un métabolite de la voie du shikimate, vraisemblablement le préphénate. Des expériences de marquage ont démontré que ce métabolite est la source de groupement hydroxyle utilisé dans la voie anaérobie de biosynthèse de l’UQ. Ces résultats révèlent la première molécule organique utilisée comme donneur d’hydroxyle dans des réactions biologiques et suggèrent que les protéines appartenant à la même famille qu’UbiU-V pourraient fonctionner de façon similaire. Par ailleurs, des analyses génétiques et physiologiques ont montré que l’expression d’UbiU-V est régulée par FNR, un régulateur transcriptionnel sensible à l’O2, et qu’UbiU-V procurent un léger avantage à E. coli pour coloniser l’intestin de souris, une de ses niches écologiques. Dans l’ensemble, nos résultats révèlent qu’UbiTUV participent à la stratégie utilisée par E. coli pour s’adapter aux conditions respiratoires dans des environnements versatiles tel que l’intestin. Enfin, nous avons caractérisé la voie de biosynthèse de l’UQ chez la bactérie F. novicida. A l’aide du modèle Galleria mellonella, nous avons pu montrer pour la première fois que l’UQ contribué à la pathogénicité de cette bactérie.

Ubiquinone (UQ) is a redox lipid involved in electrons and protons transfer in the respiratory chains of eukaryotes and proteobacteria. UQ plays a central role in the bioenergetics of these organisms. The UQ biosynthesis pathway has been extensively studied in Escherichia coli. This facultative anaerobic bacterium synthesizes UQ aerobically via an O2-dependent pathway and anaerobically via an O2-independent pathway. These two multi-step pathways involve various enzymes and accessory proteins. Some are common to both pathways (UbiA to UbiE, UbiG and UbiX), while others are involved only in the O2-dependent pathway (UbiI, UbiH, UbiF, UbiJ and UbiK) or in the O2-independent pathway (UbiT to UbiV). Each of the two pathways involves three hydroxylation reactions on contiguous carbon atoms of the aromatic ring of the UQ intermediates. During this thesis work, we were interested in the hydroxylation reactions of the two pathways in proteobacteria, from a biochemical, evolutionary and physiological point of view. Moreover, we also studied the role of UQ in the pathogenicity of Francisella novicida bacteria. Under aerobic conditions, all three hydroxylation reactions are catalyzed by flavin (FMOs) or iron (Coq7) monooxygenases, which use oxygen (O2) as a source of hydroxyl groups. Various combinations of hydroxylases have been shown to be used by bacteria. For example, E. coli uses three FMOs, (UbiI, H and F) while Rhodospirillum rubrum employs UbiL (FMO) and Coq7, and Neisseria meningitidis has just one enzyme, UbiM (FMO). These results suggested a varied regioselectivity (ability to hydroxylate a specific carbon of the aromatic ring) for O2-dependent hydroxylases, particularly for FMOs. We therefore explored the evolution of the regioselectivity of FMOs involved in UQ biosynthesis (Ubi-FMOs) by analyzing the genomes of 2352 species of α-, β- and γ-proteobacteria. Our phylogenetic and biochemical analyses highlighted the existence of a new FMO (UbiN) and revealed that Ubi-FMOs diversified via three duplication events associated with one case of sub-functionalization and two cases of neo-functionalization linked to a loss of Coq7. The team also demonstrated the involvement of the UbiT, U, V proteins in the O2-independent pathway of UQ biosynthesis. However, the identity of the hydroxylases and the hydroxyl group donor for O2-independent hydroxylation reactions remained to be elucidated. Through in vivo experiments, we have shown that the UbiU-V heterodimer is capable of hydroxylating all three carbon atoms of UQ intermediates, and that UbiU-V activity depends on a metabolite of the shikimate pathway, presumably prephenate. Labelling experiments demonstrated that this metabolite is the source of the hydroxyl group used in the O2-independent hydroxylation reactions of UQ biosynthesis. These results reveal the first organic molecule to be used as a hydroxyl donor in biological reactions and suggest that proteins belonging to the same family as UbiU-V could function in a similar way. In addition, genetic and physiological analyses showed that expression of UbiU-V is regulated by FNR, an O2-sensitive transcriptional regulator, and that UbiU-V provide a slight advantage to E. coli for colonizing the mouse intestine, one of its ecological niches. Overall, our results reveal that UbiTUV participate in the strategy used by E. coli to adapt to respiratory conditions in versatile environments such as the gut. Finally, we characterized the UQ biosynthetic pathway in the bacterium F. novicida. Using Galleria mellonella as a model, we were able to show for the first time that UQ contributes to the pathogenicity of this bacterium.