Etude de la polarité cellulaire et de la motilité du protozoaire Toxoplasma gondii par une approche biologique et biophysique combinée

Exploring cell polarity and motility of the protozoan Toxoplasma gondii in an innovative biological and biophysical coupled framework

• Auteur / Autrice : Luis Miguel Vigetti
• Direction : Isabelle Tardieux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 16/10/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut pour l'avancée des biosciences (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Guy Royal
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Markus Meissner, Isabelle Florent
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Delphine Delacour, Catherine Lavazec

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protozoaires

Cellules -- Motilité

Polarité (biologie)

Cytosquelette

Chimie des surfaces

Toxoplasma gondii

Mots clés libres

Toxoplasma gondii

Migration cellulaire

Microscopie en temps réel et à super résolution

Chimie de surface

Cytosquelette

Biogenèse cellulaire

Toxoplasma gondii

Cell migration

Llive and super resolution microscopy

Surface chemistry

Cytoskeleton

Cell biogenesis

Résumé

Toxoplasma gondii est un microbe eucaryote unicellulaire du phylum des parasites Apicomplexa, qui dépend strictement de cellules pour son cycle de vie chez un large spectre d'hôtes homéothermes, dont l'homme. T. gondii a développé différents stades de développement infectieux appelés zoïtes parmi lesquels le tachyzoïte. Cette cellule polarisée de quelques microns possède une forme arquée dont les deux pôles ont une organisation structurale et fonctionnelle distincte. Le tachyzoïte navigue au sein des matrices extracellulaires et envahit activement les cellules hôtes permissives à la prolifération, en exécutant un mouvement par glissement hélicoïdal. Ce glissement est sous le contrôle de machines supramoléculaires appelées « glideosomes » qui, en position sous membranaire, utilisent des myosines de la classe XIV pour déplacer des filaments d'actine néoformés et dynamiques dans un mouvement antéro-rétrograde sur la longueur du parasite. Quand le flux rétrograde d’actine est couplée à celui d’adhésines ayant capturé le ligand présenté par la matrice extracellulaire, il entraine le glissement du parasite vers l’avant. Cependant, la compréhension du couplage moléculaire entre la formation d’une adhésion et la production de force comme celle de la contribution du pole basal aux forces de mouvement restent incomplètes. Le projet de thèse a porté sur l’étude des singularités biomécaniques du tachyzoïte afin de caractériser (i) les ligands extracellulaires minimaux requis pour un glissement hélicoïdal, et (ii) la contribution structurelle et fonctionnelle de la protéine BCC7 localisée au pôle basal.Dans la première partie, nous avons combiné des micropatterns à haute résolution avec la vidéo-microscopie et la microscopie d'expansion, et mis en évidence qu'un seul site d'ancrage sur le substrat initié par l’apex du parasite et sur lequel ce dernier progresse représente une plateforme de transmission de force suffisante pour permettre un glissement hélicoïdal. Ensuite, nous avons développé une chimie de surface ajustable basée sur des PLL-PEG couplés à des plateformes de streptavidine/biotine, que nous avons contrôlées à l’aide de la technique de microbalance à cristal de quartz avec mesure de la dissipation. En criblant les ligands minimaux candidats des adhésines parasitaires requis pour le glissement, nous avons mis en évidence que la présentation de glycosaminoglycanes sulfatés sur le substrat suffit pour une interaction productive avec la surface du parasite. Nous avons également démontré que le flux membranaire antéropostérieur se produit en l'absence d'adhésion cellulaire, en tirant parti des surfaces contrôlées comme anti-adhésives. La deuxième partie de la thèse a combiné les approches de biochimie et de protéomique quantitative par spectrométrie de masse avec les microscopies dynamique et à super-résolution pour positionner BCC7 à l’extrémité de complexe de membrane interne (IMC) de la pellicule et le moteur myosine C, strictement associé au pôle basal des tachyzoïtes matures. Ces approches ont également permis de suivre le trafic antéro-postérieur de la protéine sous forme de patchs avant que le matériel maternel ne soit recyclé au sein des cellules filles naissantes. De plus, treize partenaires de BCC7 ont été identifiés, dont plusieurs font partie de la famille IMC. Deux nouvelles protéines IMC, IMC35 et IMC36, ont également été décrites ainsi que leur profil d’expression différentielle au cours du cycle cellulaire. En conclusion, ce doctorat a permis de développer une nouvelle boîte à outils biophysique d’intérêt pour étudier les mécanismes moléculaires des interfaces cellule-cellule ou cellule-surface, y compris au-delà du parasite T. gondii. Chez le parasite, il devrait permettre d’affiner le modèle mécanistique de la mobilité par glissement.

Toxoplasma gondii is a single-celled eukaryotic microbe that belongs to the large and ancient phylum of Apicomplexan parasites, and strictly depends on cells from a wide range of homeothermic metazoan hosts, human included, to achieve a complex life cycle. To succeed, T. gondii has evolved infectious developmental stages called zoites. Here, we focus on the fast-cycling tachyzoite, a several-micron-sized cell, with a strong arc-shape silhouette featured by an apical and a basal pole of distinctive architecture and functions. The tachyzoite mechanical properties determine gliding and invasive capacities and largely arise from an outlying three-layered membrane or pellicle together with the underneath basket of stable but flexible cortical microtubules. Indeed, the tachyzoite encounters extracellular compartments of various mechanical properties before invading cells within which it expands population. The tachyzoite undergoes helical gliding thanks to two sub-membranous multimolecular machineries called glideosomes which rely on class XIV myosins (A and H) to translocate newly nucleated and dynamic actin filaments in a rearward direction along the parasite length. Gliding proceeds with a focal adhesion built through the capture of an extracellular ligand by a parasite surface-exposed adhesin that bridges the former with the actin cytoskeleton. Traction force is applied at this site, thus enabling the parasite to glide over it while posteriorly disengaging from the substrate along with dragging forces. Nevertheless, how cell adhesion couple with force production during gliding or how the polar architecture contributes to these forces remain unclear. Accordingly, the Ph.D. research focused on the biomechanical singularities of the tachyzoite and brought new insights on (i) the extracellular ligand requirements beneath productive helical movement, and (ii) the structural and functional contribution of a still uncharacterized 500 kDa basal pole protein named BCC7. In the first part, we combined high-resolution micropatterns with confocal video-microscopy and expansion microscopy and found that only one apical anchoring contact built by the tachyzoite with the substrate is sufficient to assemble a force transmission platform compatible with gliding. Next, we developed tunable surface chemistry based on PLL-PEG coupled with streptavidin/biotin platforms, which we biochemically and biophysically controlled by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation monitoring to screen for minimal ligands of parasite adhesins. Using this combinatorial approach, we highlighted the sufficiency of glycosaminoglycan species as substrates for productive interaction and helical gliding. We also demonstrated that the anteroposterior membrane flow occurs in the absence of cell adhesion, taking advantage of anti-fouling surfaces. The second part combined biochemistry, mass spectrometry-based proteomics, with live and super-resolution microscopy to accurately position BCC7 at the interface between the Inner Membrane Complex (IMC) and myosinC, a motor typifying the basal pole of mature tachyzoites. These approaches also allowed monitoring of the anteroposterior trafficking of the protein as patches along with daughter cell assembly before the maternal material recycles into the newborn progeny. In addition, thirteen BCC7 partners were identified, several of which cluster in the IMC-like family. Two new IMC proteins, IMC35 and IMC36, were also described and shown to be differently expressed during the cell cycle. Therefore, this Ph.D. offers an unprecedented biophysical toolkit to interrogate the molecular mechanisms of cell-cell or cell-surface interfaces including beyond the T. gondii parasite which has proved promising for refining the gliding mechanistic model.