Développement d'une nouvelle approche thérapeutique basée sur des nanoparticules peptidiques délivrant CRISPR-Cas9 pour le ciblage spécifique des mutations KRAS

Development of a new therapeutic approach based on peptide nanoparticles delivering CRISPR-Cas9 for the specific targeting of KRAS mutations

• Auteur / Autrice : Veronica Guzman Gonzalez
• Direction : Virginie Faure, Gilles Divita
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologie
• Date : Soutenance le 05/09/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut pour l'avancée des biosciences (Grenoble, Isère, France ; 2016-....)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Luc Lenormand
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Emmanuel Garcion, Nadir Bettache
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Alice Carrier, Emmanuel Garcion
• DOI : 10.70675/f8c09968z97c4z4635za591z74bf90b6fe70

Mots clés

Mots clés contrôlés

Gènes

Gène KRAS

Oncogènes

CRISPR-Cas9

Mots clés libres

Nanovehicule

CRISPR/Cas9

Oncogènes

Kras

CRISPR/cas9

Oncogenes

Nanovehicule

Résumé

Le système CRISPR-Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat-CRISPR-associated protein 9) est apparu comme un outil révolutionnaire d'édition de gènes doté d'un énorme potentiel thérapeutique pour cibler directement les gènes à l'origine de diverses maladies telles que le cancer. KRAS est l'oncogène le plus fréquemment muté dans le cancer humain. Ses mutations G12D et G12V sont majoritaires dans l’initiation des mécanismes de carcinogénèse et se retrouvent notamment dans les cancers du pancréas et colorectal, Ces mutations restent des cibles cancéreuses les plus difficiles à atteindre. Le système CRISPR-Cas9 offre donc une opportunité intéressante de cibler ces mutations cancérigènes.Cependant, plusieurs défis doivent être relevés avant de pouvoir l'utiliser en clinique. L'un des facteurs clés est la méthode d'administration. Outre le risque de dégradation de la nucléase et l'élimination rapide du système CRISPR-Cas9 par les macrophages, la grande taille de Cas9, la forte densité de charge anionique et la nature hydrophile de l'ARN constituent un obstacle important à la délivrance intracellulaire et à l'efficacité globale de la transfection des gènes.Nous avons donc développé de nouvelles nanoparticules à base de peptides (PBN) qui constitue un système de vectorisation qui a été identifié comme l'une des stratégies non virales les plus prometteuses pour l'administration intracelullaire d'acides nucléiques. Nous avons démontré que ces PBN forment des complexes stables avec l'ARNm Cas9 et son ARNg et qu'elles sont capables de protéger les composants de l'ARN CRISPR-Cas9 de la dégradation par les nucléases. En utilisant la microscopie confocale à fluorescence, nous avons confirmé la délivrance intracellulaire du système. Nous avons d'abord vérifié que le système CRISPR-Cas9 délivré était fonctionnel en ciblant le gène rapporteur de la luciférase. Les PBN ont généré efficacement le knock-out du gène de la luciférase in vitro sans aucune cytotoxicité apparente. Les PBN ont permis d’éditer de manière robuste le gène de la luciférase avec une efficacité de 60 % et une diminution de 50 % de l'activité globale de celle-ci. De plus, nous avons montré que les PBN ont pu cibler les mutations prédominantes du gène KRAS, atteignant une efficacité de 20 % pour la mutation G12D et de 60 % pour la mutation G12V. La phosphorylation des principales protéines en aval des voies de signalisation de KRAS a été régulée à la baisse et le taux de prolifération cellulaire a été rétabli après l'édition CRISPR-Cas9.Nous avons montré pour la première fois, que des nanoparticules à base de peptides étaient capables de délivrer dans des cellules cancéreuses le système CRISPR-Cas9 sous forme d’ARN et de cibler de manière efficace les mutations G12D et G12V de l’oncogène KRAS. Nos résultats soulignent l'importance d'un système d'administration approprié pour délivrer CRISPR-Cas9 et ouvrent des perspectives thérapeutiques prometteuses pour cibler les mutations de KRAS participant au développement du cancer.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat-CRISPR-associated protein 9 (CRISPR-Cas9) system has emerged as a revolutionary gene-editing tool with huge therapeutic potential to address the genetic root causing diverse diseases such as cancer. KRAS is the most frequently mutated oncogene in human cancer. Its predominant mutations at codon 12, G12D and G12V, are main drivers in common cancers, including pancreatic and colorectal cancers. KRAS mutations remain one of the most challenging cancer targets. CRISPR-Cas9 system provides an attractive opportunity to target these cancer-causing mutations. However, there are several challenging factors that must be addressed for its use in clinic. One key factor is the delivery method. In addition to the risk of nuclease degradation and rapid CRISPR-Cas9 system clearance by macrophages, the large size of Cas9, the high anionic charge density and hydrophilic nature of the RNA impose a significant barrier to their intracellular delivery and overall gene transfection efficiency.We developed new Peptide Based Nanoparticles (PBN), a delivery system that has been identified as one of the most promising non-viral strategies for the intracelullar delivery of nucleic acids. We demonstrated that these PBN form stable complexes with Cas9 mRNA and its sgRNA and are able to protect the CRISPR-Cas9 RNA components from nuclease degradation. Using fluorescence confocal microscopy, we confirmed the intracelular delivery of the system. We first verified the delivery of a funcional CRISPR-Cas9 system by targeting the reporter gene luciferase. PBN efficiently generated the knock-out of the luciferase gene in vitro without any apparent cytotoxicity. PBN produce robust gene editing with 60% efficiency and 50% decrease of overall luciferase activity. Furthermore, PBN were able to target the predominant KRAS mutations, reaching 20% of gene editing efficiency for the G12D mutation and 60% for the G12V mutation. The phosphorylation of key downstream proteins in KRAS signaling pathway was downregulated, and cell proliferation rate was recovered after CRISPR-Cas9 editing.We showed for the first time that peptide-based nanoparticles were able to deliver the CRISPR-Cas9 system in the form of RNA in cancer cells and to effectively target the G12D and G12V mutations of the KRAS oncogene. Our results highlight the importance of an appropriate delivery system to deliver CRISPR-Cas9 and open up promising therapeutic perspectives to target KRAS mutations involved in cancer development.