Caractérisation structurale et biochimique du complexe de liaison de la coiffe nucléaire de Trypanosoma brucei

Structural and biochemical characterization of the nuclear cap binding complex ofTrypanosoma brucei

• Auteur / Autrice : Harald Bernhard
• Direction : Eva Kowalinski
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 05/05/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : European molecular biology laboratory (Grenoble, Isère, France ; 1976-....)
• Jury : Président / Présidente : Wim Burmeister
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Maria Selmer, Janosch Hennig
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Maria Selmer, Janosch Hennig

Mots clés

Mots clés contrôlés

Trypanosomiase africaine

Trypanosoma

Cohésine

Mots clés libres

Complexe protéique

Biologie structurale

Trypanosoma

Trypanosoma

Cap binding complex

Structural biology

Résumé

Les maladies à transmission vectorielle sont des maladies infectieuses qui sont fortement influencées par le réchauffement climatique, car les changements environnementaux ont un impact sur les espèces d'arthropodes transmetteurs, comme les moustiques et les punaises triatomes. Elles comprennent une classe de parasites protozoaires appelés kinétoplastides qui provoquent diverses maladies humaines et animales et revêtent une importance médicale et économique. L'un de ces parasites, Trypanosoma brucei, est l'agent causal de la maladie du sommeil africaine, une maladie tropicale négligée qui est fatale lorsqu'elle n'est pas traitée.Les parasites kinétoplastides ont une voie unique de maturation de l'ARNm, pour laquelle ils utilisent le trans-épissage. Dans le cas du transépissage, les gènes sont transcrits sous forme de cassettes de pré-ARNm polycistroniques qui portent plusieurs gènes pour des protéines de fonction non apparentée. Pour maturer ces transcrits en ARNm traduisibles, ils sont clivés en unités d'ARNm monocistroniques par trans-épissage d'un ARN leader épissé (ARNSL) coiffé en 5'.L'ARN SLR possède une coiffe m7GTP hautement méthylée, appelée cap-4, et porte sept méthylations sur les quatre premiers nucléotides. Cette structure m7Gpppm62AmpAmpCmpm3Um porte des méthylations 2-O sur le ribose des quatre premiers nucléotides, et les 1er et 4e nucléotides sont en outre méthylés sur leur fraction de base azotée. Il s'agit notamment d'une modification m62A sur le premier nucléotide et d'une modification m3U sur le 4e nucléotide. Il a été démontré que les méthylations sur le cap-4 sont nécessaires pour un trans-épissage efficace.Le complexe de liaison de la coiffe nucléaire eucaryote est un complexe protéique hétérodimérique conservé chez la plupart des eucaryotes. Il se lie à la coiffe 5' de l'ARNm nouvellement transcrit. Les fonctions de ce complexe comprennent la stabilisation de l'ARNm en le protégeant de la dégradation et l'amélioration de l'épissage du pré-ARNm en augmentant le taux d'épissage. De plus, il agit comme une étiquette d'identification pour les protéines de la machinerie de traitement de l'ARNm. La CBC eucaryote canonique comprend une petite sous-unité ∼20 kDa et une plus grande sous-unité ∼80 kDa, formant un complexe protéique hétérodimérique obligatoire. Il a été démontré que plusieurs interacteurs se lient au CBC et jouent différents rôles dans la maturation des ARNm.Le complexe de liaison de la coiffe nucléaire de Trypanosoma brucei diffère du complexe eucaryote canonique. Il a été décrit comme un complexe de liaison à la coiffe nucléaire de 300 kDa composé de 5 sous-unités différentes. Deux sous-unités, CBP20 et importin-α, présentant une homologie de séquence avec d'autres eucaryotes, ainsi que trois protéines (CBP30, CBP66 et CBP110) qui sont uniques aux kinétoplastides. Grâce à ses caractéristiques particulières, ce complexe protéique serait un acteur clé de la maturation des ARNm en jouant un rôle dans le trans-épissage précoce. La différence dans la composition des sous-unités du TbCBC, 5 contre 2 chez les eucaryotes canoniques, et l'unique 5'-cap font du TbCBC une cible médicamenteuse potentielle.Dans mon projet de thèse, j'ai caractérisé le TbCBC d'un point de vue biochimique et structurel en utilisant la cryo-EM à une seule particule afin de déterminer si le complexe est adapté à la conception de médicaments basés sur la structure. Ma principale découverte est une structure à haute résolution de TbCBP20/30/110 liée à un cap-4 synthétisé chimiquement. Avec les données biochimiques, j'ai pu montrer que TbCBP20/110 forme un complexe central et que CBP66 est lié de manière flexible par TbCBP30 comme sous-unité de pontage. Nous avons commencé les premières étapes vers l'exploitation de l'interaction de TbCBP30 avec le noyau comme site cible pour le développement d'un médicament peptidique potentiel.

Vector-borne diseases are infectious diseases that are greatly influenced by global warming, as the environmental changes impact the transmissive arthropod species, such as mosquitos and triatomine bugs. These include a class of protozoan parasites called kinetoplastida which cause various human and animal diseases and are of medical and economic importance. One of these parasites, Trypanosoma brucei, is the causative agent of the African sleeping sickness, a neglected tropical disease that is fatal when left untreated.Kinetoplastid parasites have a unique mRNA maturation pathway, for which they use trans-splicing. In trans-splicing, genes are transcribed as polycistronic pre-mRNA cassettes that carry several genes for proteins of unrelated function. To mature these transcripts into translatable mRNAs, they are cleaved into monocistronic mRNA units by trans-splicing a 5’-capped spliced leader RNA (SLRNA).The SLRNA has a highly methylated m7GTP cap, called the cap-4, and carries seven methylations on the first four nucleotides. This m7Gpppm62AmpAmpCmpm3Um structure carries 2-O methylations on the ribose of the first four nucleotides, and the 1st and 4th nucleotides are additionally methylated on their nitrogenous base moiety. These include an m62A modification on the first nucleotide and an m3U on the 4th nucleotide. It has been shown that the methylations on the cap-4 are necessary for efficient trans-splicing.The eukaryotic nuclear cap binding complex is a conserved heterodimeric protein complex among most eukaryotes. It binds to the 5’-cap of newly transcribed mRNA. The functions of this complex include mRNA stabilization by protecting it from degradation and enhancing pre-mRNA splicing by increasing the splice rate. Further, it acts as an identification tag for proteins of the mRNA processing machinery. The canonical eukaryotic CBC comprises a small ∼20 kDa subunit and a bigger ∼80 kDa subunit, forming an obligatory heterodimeric protein complex. Several interactors have been shown to bind to CBC and play different roles in mRNA maturation.The nuclear cap binding complex of Trypanosoma brucei differs from the canonical eukaryotic complex. It has been described as a 300 kDa nuclear cap binding complex consisting of 5 different subunits. Two subunits, CBP20 and importin-α, with sequence homology to other eukaryotes, together with three proteins (CBP30, CBP66 and CBP110) that are unique to kinetoplastida. With its special features, this protein complex is thought to be a key player in mRNA maturation by playing a role in early trans-splicing. The difference in subunit composition of TbCBC, 5 compared to 2 in canonical eukaryotes, and the unique 5’-cap make the TbCBC a potential drug target.In my Thesis project, I characterised TbCBC biochemically and structurally by using single-particle cryo-EM to determine whether the complex is suited for structure-based drug design. My main finding is a high-resolution structure of TbCBP20/30/110 bound to a chemical synthesised cap-4. Together with the biochemical data, I could show that TbCBP20/110 forms a core complex and CBP66 is flexibly linked by TbCBP30 as a bridging subunit. We started the first steps towards exploiting the interaction of TbCBP30 to the core as a target site for developing a potential peptide drug.