Caractérisation biochimique et cellulaire des récepteurs PROKR1 et PROKR2 et criblage structural de leur ligand PROK1 : Intérêt pour les pathologies PROK1-dépendantes

Biochemical and Cellular Characterization of PROKR1 and PROKR2 Receptors and Structural Screening of their Ligand PROK1 : Interest for PROK1-Dependent Pathologies

• Auteur / Autrice : Kévin Gemy
• Direction : Mohamed Benharouga, Nadia Alfaidy-Benharouga
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 24/03/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire biologie et biotechnologie pour la santé (Grenoble, Isère, France ; 2021-....)
• Jury : Président / Présidente : Emmanuelle Planus
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Patrice Catty, Franck Borel, Frédéric Becq
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Philippe Rondard, Christelle Coraux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chorioépithéliome

Cancer -- Thérapeutique

Néovascularisation

Mots clés libres

Prok1

Eg-Vegf

Prokr

Prokinéticine

Inflammation

Angiogénèse

Prok1

Eg-Vegf

Prokr

Prokineticin

Inflammation

Angiogenesis

Résumé

Le facteur, PROK1 aussi dénommé EG-VEGF appartient à la famille des prokinéticines (PROK), dont les membres sont directement impliqués dans le contrôle de l’inflammation et l’angiogenèse. Ces facteurs agissent via deux récepteurs de la famille des RCPG, PROKR1 et PROKR2 et régulent plusieurs processus physiologiques et pathologiques, y compris le cancer. Mon équipe de recherche a récemment démontré que l’expression de PROK1 et PROKR2 était augmentée dans le cancer du système reproducteur féminin, le choriocarcinome gestationnel (CG), et dans la mucoviscidose. L’antagonisation de PROKR2 dans un modèle animal de CG diminue le développement et la progression de ce cancer et réduit la réponse inflammatoire, suggérant que l'inhibition du système PROK1/PROKR2 pourrait constituer une cible thérapeutique prometteuse pour les cancers et les pathologies pro-inflammatoires PROK1-dépendantes. Cependant, les antagonistes anti-PROKR2 ne sont pas spécifiques pour ce récepteur, présentent une toxicité à long terme et peuvent être associés au développement d’effets secondaires. Ainsi, les objectifs de ma thèse étaient, i) de développer une nouvelle stratégie d’inhibition en ciblant le ligand, PROK1, et ii) de mettre en évidence les différences moléculaires et cellulaires des récepteurs PROKR1 et PROKR2 afin de proposer, à long terme, des stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement l’un ou l’autre récepteur. Le développement de la stratégie du blocage du ligand PROK1 a nécessité, le clonage de la séquence humaine de prok1 dans différents plasmides, la mise en place de plusieurs systèmes « eucaryotes ou procaryotes » d’expression et de production, et le développement de nombreuses techniques de purification afin de résoudre sa structure tridimensionnelle (STD). Des analyses in silico ont également été réalisées ; pour accélérer la résolution de sa STD, caractériser les interfaces de son interaction avec PROKR2, et réaliser le docking moléculaire dans le but d’identifier des molécules chimiques capables d’inhiber l’interaction PROK1-PROKR2. Un test fonctionnel a aussi été développé pour évaluer in vitro les molécules les plus prometteuses. Pour la réalisation de ce test fonctionnel, nous avons généré deux lignées stables exprimant PROKR1 ou PROKR2. La caractérisation cellulaire et moléculaire de PROKR1 et PROKR2 a mis en évidence l’existence de différences post-traductionnelles concernant les demi-vies des récepteurs, leur stabilité, leur mode d’adressage à la membrane et leurs niveaux de repliement. Partant de ce constat, nous avons débuté l’étude des mécanismes sous-jacents à ces différences en ciblant prioritairement les extrémités N- et C-ter et leurs implications dans le processus de dimérisation potentielle de PROKR1 et PROKR2.L’ensemble des résultats de ma thèse ont permis de produire la protéine PROK1, de résoudre sa structure et d’identifier les acides aminés impliqués dans son interaction avec le PROKR2. Le développement des lignées exprimant PROKR1 ou PROKR2 a permis, i) de mettre en place un test fonctionnel de l’activité des prokinéticines, ii) d’identifier trois molécules inhibitrices du ligand PROK1 et iii) de démontrer qu’en dépit de la faible différence d’identité entre PROKR1 et PROKR2, que PROKR1serait plus stable au niveau de la membrane, subirait moins de dégradation au niveau du lysosome, et que sa partie C-ter confèrerait la dimérisation entre récepteurs PROKRs.En conclusion, ma thèse a apporté des outils moléculaires pour l’étude des prokinéticines, a permis d’identifier de nouvelles molécules inhibitrices du ligand PROK1 et de son interaction avec PROKR2 et à comparer pour la première fois les deux récepteurs de cette famille. L’ensemble de ces données nous permettra de mieux cibler les récepteurs PROKRs et leurs ligands afin de proposer une pharmacothérapie plus spécifique des cancers PROK-dépendants et des maladies inflammatoires dans lesquelles ils sont dérégulés, comme la prééclampsie et la mucoviscidose.

Prokineticin-1 (PROK1) protein, also known as EG-VEGF (Endocrine gland derived-vascular endothelial growth factor) belongs to the prokineticin (PROK) family, whose members are directly involved in the control of key processes such as inflammation and angiogenesis. PROK1 acts via two GPCR receptors, PROKR1 and PROKR2 and regulates several physiological and pathological processes, including cancer and cystic fibrosis (CF). My research team recently demonstrated that the expression of PROK1 and PROKR2 were increased in the female reproductive cancer, gestational choriocarcinoma (GC) and in CF. The antagonization of PROKR2 in an animal model of GC decreased tumor growth and its progression, suggesting that inhibition of the PROK1/PROKR2 system may constitute a promising therapeutic target for all PROK1-dependent cancers and pro-inflammatory diseases. However, anti-PROKR2 antagonists are not specific for this receptor, exhibit long-term toxicity and may be associated with the development of side effects as they block a shared receptor with other members of the PROKs family.The objectives of my thesis project aimed at i) developing a new strategy that targets the inhibition of the ligand, PROK1, and ii) characterizing the molecular and cellular features that differentiate PROKR1 from PROKR2 in order to propose new therapeutic strategies that will specifically target one or the other receptor.The development of the PROK1 blocking strategy required the cloning of the human Prok1 sequence in different plasmids, the implementation of several eukaryotic or prokaryotic expression and production systems, and the development of numerous purification techniques in order to resolve its three-dimensional structure (STD). In silico analyses were also performed to accelerate the STD resolution of PROK1, to characterize the sites of its interaction with PROKR2, and to perform molecular docking in order to identify chemical molecules able to inhibit the PROK1-PROKR2 interaction. A functional assay was also developed to test in vitro the most promising molecules. The functional test required the development of two stable cell lines expressing PROKR1 or PROKR2.The cellular and molecular characterization of PROKR1 and PROKR2 revealed post-translational differences regarding the receptor’s half-life, its stability, trafficking and folding levels. Based on these observations, we initiate the investigation of the mechanisms behind these differences, firstly by targeting the roles of N- and C-terminus in these processes, particularly in the dimerizations of PROKR1and PROKR2.Altogether my thesis project allowed the production of a recombinant PROK1 protein, the resolution of its structure and the identification of the amino acids that are involved in its interaction with PROKR2. The development of cell lines expressing PROKR1 or PROKR2 allowed, i) the set-up of a functional test of the activity of prokineticins, ii) the identification of three inhibiting molecules of the PROK1 ligand and iii) the demonstration that, in spite the existence of a huge identity between PROKR1 and PROKR2, PROKR1 would be more stable at the plasma membrane; undergo less degradation at the lysosome level and its C-terminal part may confer the dimeristaion between PROKRs receptors.In conclusion, my thesis project established new molecular tools for the study of the prokineticins system; identified new inhibiting molecules of the PROK1-PROKR2 interaction, and compared for the first time PROKRs cellular and biochemical features. All these data will allow better targeting of PROKRs and their ligands in order to propose more specific pharmacotherapies for PROK-dependent cancers and inflammatory diseases, such as preeclampsia and cystic fibrosis.