Caractérisation structurale des protéines P et C encodées par des séquences chevauchantes chez les Orthoparamyxovirinae

Structural characterization of Orthoparamyxovirinae P and C proteins encoded by overlapping sequences

• Auteur / Autrice : Ada Roy
• Direction : Marc Jamin, Jean-Marie Bourhis
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie microbiologie immunologie
• Date : Soutenance le 09/03/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Emmanuel Drouet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Marie Bourhis, Denis Gerlier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Branka Horvat, Pau Bernadó

Mots clés

Mots clés contrôlés

Virus Nipah

Résistance aux maladies

Relations hôte-virus

Mots clés libres

Réponse immunitaire innée

Orthoparamyxovirinae

Interactions virus-Cellule hôte

Biologie structurale

Virus Nipah

Paramyxovirus de la Toupaye

Nipah virus

Innate immune response

Orthoparamyxovirinae

Virus-Host cell interactions

Structural biology

Tupaia Paramyxovirus

Résumé

La famille des Paramyxoviridae est une grande famille de virus à ARN négatif non-segmenté dont certains sont pathogènes pour l’homme ou les animaux domestiques. Leur génome de taille réduite comprend six unités de transcription, dont celle codant pour la phosphoprotéine P qui est polycistronique et permet la production, d’une part, de la phosphoprotéine, un composant essentiel pour le fonctionnement de la machine de synthèse d’ARN, et d’autre part, d’une ou de plusieurs protéines accessoires, notamment impliquées dans l’échappement au système immunitaire. En particulier, le génome de la plupart des membres de la sous-famille des Orthoparamyxovirinae contient un gène surimprimé dans la séquence du gène codant pour la phosphoprotéine mais dans un cadre de lecture différent. Les cellules infectées par ces virus expriment ainsi une protéine accessoire C par un mécanisme d’initiation alternative de la traduction. Cette protéine est multi-fonctionnelle, elle est impliquée dans la régulation de la synthèse d’ARN viral, dans l’antagonisme de la réponse immunitaire innée et dans le bourgeonnement de nouvelles particules virales. Pour certains virus, cette protéine est un facteur de virulence. Mais, nous manquons d’information sur la structure et les mécanismes d’action de la protéine C.Mon travail avait pour objectif de caractériser la structure de la protéine C de deux paramyxovirus, seule ou en complexe avec des partenaires cellulaires, afin de mieux comprendre comment cette protéine peut agir dans les cellules infectée.Des études bio-informatiques ont confirmé la conservation d’une architecture commune à l’ensemble des protéines C des Orthoparamyxovirinae et l’existence d’une région N-terminale désordonnée et d’un domaine structuré en hélice- dans la partie C-terminale de la protéine. Nous avons exprimé et purifié la protéine C du paramyxovirus de la toupaye (TPMV) ainsi qu’un fragment C-terminal et nous avons déterminé la structure cristallographique de ce dernier. En dépit d’une faible similarité de séquence, la structure tridimensionnelle indique un repliement similaire à celui du domaine C-terminal du virus Sendai. A partir de données de diffusion de rayons X aux petits angles, nous avons pu établir un modèle d’ensemble de la protéine entière. En collaboration, nous avons montré que la protéine C du TPMV inhibe la machinerie de synthèse d’ARN du virus Nipah. Il a notamment été démontré dans le cas du virus de la rougeole que la protéine C inhibe la synthèse d’ARN par une interaction avec la phosphoprotéine. Dans cette optique, nous avons entrepris la caractérisation structurale de la phosphoprotéine du TPMV et nous avons cherché à déterminer si elle interagit avec la protéine C.Nous avons utilisé différentes stratégies pour exprimer et purifier la protéine C du virus Nipah, seule ou en complexe avec des partenaires cellulaires. Par une méthode de criblage à haut débit, nous avons défini plusieurs constructions solubles et nous avons utilisé une de ces protéines pour générer des nanobodies de lama qui seront utilisés comme chaperons de cristallisation. En collaboration, nous avons montré par les méthodes de double hybride en levure et de TAP-TAG MS que la protéine C du NiV se lie à la protéine VPS37B (Vacuolar Protein Sorting 37 Homolog B) du sous-complexe cellulaire ESCRT-I de la machinerie ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport I). Nous avons co-exprimé la protéine C avec le sous-complexe ESCRT-I et montré que la protéine C s’associe à ces protéines.En conclusion, mes travaux démontrent que les protéines C des Orthoparamyxovirinae partagent une structure commune et peuvent agir de manière croisée entre espèces appartenant à des genres différents suggérant qu’elles ont une origine commune.

The Paramyxoviridae family is a large family of non-segmented negative RNA viruses, some of which are pathogenic to humans or domestic animals. Their small genome comprises six transcription units, including the one coding for the phosphoprotein, which is polycistronic and allows the production of both the phosphoprotein, an essential component for the functioning of the RNA synthesis machinery, and one or more accessory proteins, notably involved in the escape from the immune system. In particular, the genome of most members of the Orthoparamyxovirinae subfamily contains a superimposed gene in the sequence of the gene coding for the phosphoprotein but in a different reading frame. Cells infected with these viruses thus express an accessory protein C by a mechanism of alternative translation initiation. This protein is multi-functional and is involved in regulating viral RNA synthesis, antagonising the innate immune response and budding new viral particles. For some viruses, this protein is a virulence factor. However, we lack information on the structure and mechanisms of action of protein C.The aim of my work was to characterise the structure of the C protein of two paramyxoviruses, alone or in complex with cellular partners, in order to better understand how this protein can act in infected cells.Bioinformatics studies confirmed the conservation of a common architecture to all Orthoparamyxovirinae C proteins and the existence of a disordered N-terminal region and a helix-structured domain in the C-terminal part of the protein. We expressed and purified the C protein of Tupaia paramyxovirus (TPMV) as well as a C-terminal fragment and determined the crystallographic structure of the latter. Despite low sequence similarity, the three-dimensional structure indicates a folding similar to that of the Sendai virus C-terminal domain. Using small-angle X-ray scattering data, we were able to establish an overall model of the entire protein. In collaboration, we have shown that the TPMV C protein inhibits the RNA synthesis machinery of Nipah virus. In particular, it has been shown in the case of measles virus that protein C inhibits RNA synthesis through an interaction with the phosphoprotein. With this in mind, we undertook the structural characterisation of the TPMV phosphoprotein and investigated whether it interacts with the protein C.We used different strategies to express and purify the Nipah virus C protein, alone or in complex with cellular partners. Using a high-throughput screening method, we defined several soluble constructs and used one of these proteins to generate llama nanobodies to use as crystallisation chaperones. In collaboration, we have shown by yeast two-hybrid and TAP-TAG MS methods that NiV C protein binds to the VPS37B (Vacuolar Protein Sorting 37 Homolog B) protein of the ESCRT-I cellular subcomplex of the ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery. We co-expressed the protein C with the ESCRT-I subcomplex and showed that the protein C associates with these proteins.In conclusion, my work demonstrates that the C proteins of the Orthoparamyxovirinae subfamily share a common structure and can cross-act with species belonging to different genera suggesting that they have a common origin.