Développement de thérapie génique par CRISPR/Cas9 appliquée aux myopathies liées à RYR1

Development of gene therapy by CRISPR/Cas9 for RYR1-Related myopathies

• Auteur / Autrice : Mathilde Beaufils
• Direction : Isabelle Marty
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie physiopathologies pharmacologie
• Date : Soutenance le 31/01/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Equipe - Isabelle Marty - CSV - Myologie et Pathologies
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des neurosciences de Grenoble (Isère, France ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Charles Coutton
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marc Bartoli
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Mireille Cossée, Marc Bitoun

Mots clés

Mots clés contrôlés

CRISPR-Cas9

Thérapie génique

Maladies musculaires

Mots clés libres

Relâchement de calcium

Myopathies

Thérapie génique

CRISPR/Cas9

RyR1

CRISPR/Cas9

Gene therapy

Myopathies

Calcium release

RyR1

Résumé

La contraction des cellules dans le muscle squelettique est constituée d’une succession d’étapes qui nécessitent d’être finement régulées et sont dépendantes du calcium. La membrane plasmique des cellules musculaires est formée d’invaginations appelées tubules T. Chaque tubule T est entouré de deux citernes terminales du réticulum sarcoplasmique qui constitue les stocks calciques de la cellule. Enchâssés dans la membrane des tubules T sont localisés les récepteurs des dihydropyridines (DHPR). Ils sont en lien direct avec les récepteurs à la ryanodine de type 1 (RyR1). Ces canaux calciques sont eux localisés dans la membrane du réticulum sarcoplasmique. L’excitation de la cellule musculaire par le motoneurone induit une dépolarisation de la membrane plasmique, d’abord localisée. Puis, cette dépolarisation se propage jusque dans les tubules T et va activer les DHPR qui sont sensibles au voltage. Leur changement de conformation va permettre aux RyR1 de s’ouvrir et libérer le calcium dans le cytoplasme, engendrant la contraction des unités contractiles de la cellule, les sarcomères. L’ensemble des étapes allant de la dépolarisation de la membrane à la contraction des cellules musculaires constituent le couplage excitation contraction. L’homéostasie calcique est donc primordiale à la contraction et le canal RyR1 à un rôle clé dans les relâchements de calcium la régulant. Les myopathies liées à RyR1 sont un groupe de pathologies génétiques, toutes due à au moins une mutation dans le gène RYR1 codant pour le canal calcique du même nom. Ces pathologies ont toutes en commun une faiblesse musculaire. La sévérité peut être modérée à sévère suivant les cas. Il n’existe actuellement aucun traitement pour ces pathologies.Dans une première étude, notre équipe a fait la démonstration d’une approche de thérapie génique par saut d’exon par l’utilisation d’oligonucléotides antisens, applicable chez une famille atteinte d’une myopathie liée à RYR1. Malgré des résultats très satisfaisants, cette approche n’a pas pu être développée vers la clinique en raison de l’aspect ultra personnalisé de l’approche. Ce travail de thèse s’inscrit à la suite de cette étude, avec pour objectif de développer une approche moins personnalisé où un même traitement serait donc applicable à plus de patients en même temps. L’objectif de cette thèse était de réaliser une preuve de concept de thérapie génique par CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (CRISPR associated protein 9) pour les myopathies liées à RYR1.Dans un premier temps, nous avons développé une stratégie de délétion intronique applicable à la même famille de patients que celle de la première étude menée par l’équipe. A travers ce projet, nous avons pu réaliser la délétion attendue dans des cellules de patients immortalisées. De plus, nous avons démontré le système utilisé pour maitriser la production de la nucléase SpCas9 dans les cellules dans le but de limiter au maximum l’activité off¬ target. Dans un second temps, nous avons utilisé CRISPR/Cas9 afin de développer de nouveaux modèles cellulaires à partir de cellules musculaires immortalisées issues d’un sujet sain. Ces nouvelles lignées ont un gène d’intérêt éteint et constituent de nouveaux outils pour l’étude du couplage excitation contraction, aussi bien dans un contexte physiologique que pathologique. Dans un troisième temps, nous avons développé une approche thérapeutique indépendante des mutations des patients. Cette approche vise l’allèle porteur de la mutation, et pourrait ainsi être applicable à tous les patients atteints de myopathies liées à RYR1 en raison d’une mutation à transmission dominante. De plus, cette approche pourrait également être applicable, sous certaines conditions, à d’autres pathologies.

The contraction of skeletal muscle cells consists of a succession of steps dependent of the calcium homeostasis and that need to be finely regulated. The plasma membrane of muscle cells is formed of invaginations called T-tubules. Each T-tubule is surrounded by two terminal cisternae of the sarcoplasmic reticulum, which constitute the calcium stores of the cell. Embedded in the membrane of the T-tubules are the dihydropyridine receptors (DHPR). They are directly linked to type 1 ryanodine receptors (RyR1). These calcium channels are located in the membrane of the sarcoplasmic reticulum. The excitation of the muscle cell by the motoneuron induces a depolarization of the plasma membrane. This depolarization spreads to the T-tubules and activates the DHPRs that are voltage sensors. Their conformation thus changes, allowing RyR1 to open and release calcium into the cytoplasm, generating the contraction of the contractile units of the cell, the sarcomeres. All these steps from depolarization of the membrane to contraction of the muscle cells is call the excitation contraction coupling. Calcium homeostasis is therefore crucial to contraction and the RyR1 channel has a key role in the release of calcium that regulates it. RYR1-related myopathies (RYR1-RM) are a group of genetic pathologies, all due to at least one mutation in the RYR1 gene coding for the calcium channel of the same name. These pathologies all have in common muscular weakness. The severity can be moderate to severe depending on the case. There is currently no treatment for these pathologies.In a first study, our team demonstrated an exon skipping gene therapy approach using antisense oligonucleotides, applicable to a family RYR1-RM. Despite very satisfactory results, this approach could not be developed towards the clinic because of the ultra personalized aspect of the approach. This thesis work is a continuation of this study, with the objective of developing a less personalized approach where one treatment would be applicable to more patients at the same time. The objective of this thesis was to develop a proof of concept of CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (CRISPR associated protein 9) gene therapy for RYR1-RM.Firstly, we developed an intronic deletion strategy applicable to the same family as the first study conducted by the team. Through this project, we were able to perform the expected deletion in immortalized patient’s cells. Furthermore, we demonstrated the system used to control the production of the SpCas9 nuclease in the cells in order to limit the off-target activity as much as possible. Secondly, we used CRISPR/Cas9 to develop new cellular models from immortalized muscle cells from a healthy subject. These new lines have a gene of interest knockout and constitute new tools for the study of excitation-contraction coupling, both in a physiological and pathological context. Thirdly, we have developed a therapeutic approach independent of the patient's mutations. This approach targets the mutated allele, and could thus be applicable to all patients with RYR1-RM due to a dominantly inherited mutation. Moreover, this approach could also be applicable, under certain conditions, to other pathologies and even more patients.