Biosynthèse, dépolymérisation, détection et analyse des glycosaminoglycanes et de l‘heparosane en particulier

Biosynthesis, Depolymerization, Detection, and Analysis of Glycosaminoglycans with a focus on heparosan

• Auteur / Autrice : Malgorzata Sulewska
• Direction : Bernard Priem, Rita Gerardy-Schahn
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie Biologie
• Date : Soutenance le 13/01/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes en cotutelle avec Medizinische Hochschule Hannover
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherches sur les macromolécules végétales (Grenoble ; 1966-....) - Medizinische Hochschule Hannover
• Jury : Président / Présidente : Corinne Mercier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mélanie Leroux
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Lothar Elling, Régis Daniel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Glycosaminoglycanes

Mots clés libres

Glycosaminoglycanes

Synthèse et dégradation des héparosane

Lectine artificielle

Héparosane lyase

Xcge-Lif

Glycosaminoglycans

Heparosan synthesis and degradation

Artificial lectin

Heparosan lyase

Xcge-Lif

Résumé

Les glycosaminoglycanes (GAGs) sont des polymères linéaires constitués d’une répétition d’unités disaccharidiques (diGAGs) présentant une forme hétérogénéité. Ils sont impliqués dans un grand nombre de processus biologiques, tels que la différentiation cellulaire et la cancérisation, où ils peuvent faire office de bio-marqueurs spécifiques de ces états physiologiques. Certaines bactéries synthétisent des GAGs. Par exemple, E. coli K5 produit de l’héparosan, un GAG non immunogène et biocompatible contre lequel la production d'anticorps est difficile. Par conséquent, les réactifs reconnaissant spécifiquement l'héparosane sont limités.Dans cette thèse, nous décrivons d’une partle développement d’outils de détection de l’héparosan et autres GAGs dans des extraits biologiques; et d’autre part une étude de la biosynthèse bactérienne de l’héparosan.Le développement d'outils analytiques a commencé par l'ingénierie de la protéine tailspike spécifique à l'héparosane (KflB). A l’aide d’une approche de mutagénèse dirigée basée sur une analyse structurale, l’activité enzymatique de KflB est neutralisée tout en conservant ses propriétés de fixation à l’héparosan (lectine artificielle). Afin de caractériser le mécanisme catalytique de KflB, deux approches basées sur l’analyse HPLC sont mises en œuvre: (i) la digestion de l’héparosan par KflB et la détection des produits de dégradation à λ = 250 nm; (ii) Des nonamères d’héparosan marqués à la fluorescence (chapitre 2) sont utilisés comme substrats de KflB. Nos résultats montrent que KflB est une lyase qui génère une double liaison au niveau des résidus glucuronyles. Cette activité est de nature endolytique et processive. Un domaine C-terminal chaperone (CTD) est nécessaire au repliement correct de l’enzyme; celui-ci est détaché de façon autolytique pour libérer l’enzyme mature. Par alignement avec la protéine homologue KflA et mutagénèse dirigée, les acides aminés F202 et E204 sont identifiés comme essentiels à la catalyse. Un mutant alanine au niveau de ces positions se révèle inactif mais garde ses propriétés de liaison ce qui en fait un agent de détection de l’héparosan.Ensuite (chapitre 3), nous développons une technique d’analyse applicable aux GAGs en général. Pour cela, nous adaptons une analyse multiplexe en gel d’électrophorèse capillaire avec détection de fluorescence laser (xCGE-LIF).Ceci nécessite la construction d’une bibliothèque de référence basée sur les temps de rétention, réalisée à partir de diGAGs commerciaux marqués à l’AMAC et analysés par xCGE-LIF. Nous montrons que les isomères diGAGs peuvent être détectés avec une grande fiabilité et sensibilité. Afin d’analyser les GAGs dans des extraits biologiques, nous utilisons des lyases spécifiques afin de générer des diGAGs, marqués à l’AMAC puis analysés en comparaison des différents standards. Nous appliquons ensuite cet étalonnage à l’étude des variations de la composition en GAGs au cours de la différentiation cellulaire. Les résultats préliminaires obtenus avec des hESCs indiquent que la composition en diGAGs est altérée. Il s’en dégage que notre protocole d’analyse s’avère particulièrement intéressant comme outil d’analyse des GAGs.Le cluster des gènes de capsule d’E. coli K5 est composé de kfiA-D. Alors que KfiAC sont des synthases confirmées, le rôle de KfiB est méconnu. A partir d’une analyse des banques de données, nous identifions une série d’isoformes de KfiB qui diffèrent au niveau d’une séquence répétée, ce qui constitue la base du chapitre 4. Afin d’explorer l’importance de ce motif, nous entreprenons la génération des isoformes contenant un, deux, et quatre motifs (KfiB1r, KfiB2r et KfiB4r). Les gènes de synthèse sont exprimés dans E. coli BL21-kfiCAD et nous avons évalué leur impact sur la synthèse et la distribution de l'héparosane. Bien qu'une tendance vers des chaînes plus longues était visible si KfiB1r et KfiB4r étaient co-exprimés, l'impact de KfiB n'a pu être déterminé que partiellement.

Glycosaminoglycans (GAGs) are linear anionic polymers built of repeating heterogeneously modified disaccharide units. As GAGs have a massive impact on various biological processes, including cell differentiation and cancer progression, there is a significant interest in developing GAG-based biomarkers. Some bacteria synthesize GAGs. For instance, E. coli K5 produces heparosan, a nonimmunogenic and biocompatible GAG against which antibody production is challenging. Consequently, reagents specifically recognizing heparosan are limited.Work in the course of my PhD thesis addresses the development of tools with which heparosan and other GAGs can be detected in biological samples and, secondly, the study of heparosan biosynthesis.The development of analytical tools started with engineering the heparosan-specific tailspike protein (KflB). Using a structure-guided mutational approach, the enzymatic function of KflB was inactivated and the protein transformed into a heparosan-binding protein (an artificial lectin). To fully characterize the functional mechanism of KflB, we designed two HPLC-based assays: (i) Heparosan was digested with KflB, and the products were visualized at λ = 250 nm. (ii) Fluorescently labeled heparosan nonamers (see Chapter 2) were used as KflB substrates. Our results suggest that KflB is a lyase and breaks glycosidic bonds with the formation of a double bond in the uronic acid residue. Moreover, product profiles reveal an endolytic, processive mode of action. Notably, a C-terminal chaperone domain (CTD), present in KflB, was shown to be essential for proper folding but autocatalytically released from the mature protein. Using homology modeling on the highly related KflA and site-directed mutagenesis, the amino acids F202 and E204 were identified as critical for catalytic activity. A mutant with alanine in these positions was inactive but retained heparosan binding function, thus turning into a new heparosan detection tool.Next (Chapter 3), we focused on developing an analysis technology suited to all GAGs. Therefore, we adapted multiplexed capillary gel electrophoresis with laser-induced fluorescence detection (xCGE-LIF) for GAGs analysis. The prerequisite for this type of analysis was establishing a reference database (migration time database). We used commercially available GAG-disaccharides (diGAGs), labeled them with AMAC (2-Aminoacridone), and applied the established xCGE-LIF analysis. We show that diGAG-isomers can be detected with great sensitivity and reliability. For the measurement of GAGs isolated from biological samples, we used GAG-specific lyases to generate diGAGs, labeled them with AMAC, and recorded migration times in electropherograms. Peak assignment was achieved using the established migration time database. After the proof-of-concept studies, we examined GAGs expression during cell differentiation. Preliminary results with hESCs indicate that the diGAGs composition alters during cell differentiation. Our protocol revealed the promising potential to be a powerful tool in GAGs analytics.The E. coli K5 capsule cluster contains four genes, kfiA-D. While KfiA and KfiC are confirmed heparosan synthases, the role of KfiB is unknown. Identifying KfiB isoforms with varying numbers of a spatially defined sequence designated as KfiB-repeat prompted the third study (Chapter 4). To explore the role of KfiB-repeat, we generated KfiB isoforms with one, two, and four repeats (KfiB1r, KfiB2r, and KfiB4r). Synthetic genes were expressed in E. coli BL21-kfiCAD derivative, and we evaluated their impact on heparosan synthesis and distribution. Although a tendency towards longer chains was visible if KfiB1r and KfiB4r were co-expressed, the impact of KfiB could only partially be determined.