Modélisation du pied diabétique : Etude des ADSCs et de leur sécrétome

Modeling of diabetic foot ulcer : Study of ADSCs and their secretome

• Auteur / Autrice : Iris Lemeunier
• Direction : Nathalie Picollet-D'Hahan, Stéphanie Porte
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologie, instrumentation, signal et imagerie pour la biologie, la médecine et l'environnement
• Date : Soutenance le 09/06/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale ingénierie pour la santé, la cognition, l'environnement (Grenoble ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire biologie et biotechnologie pour la santé (Grenoble, Isère, France ; 2021-....)
• Jury : Président / Présidente : Matthieu Roustit
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Olivier Preynat-Seauve
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Christelle Bonod-Bidaud, Danièle Noël

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lésions et blessures

Pied diabétique

Mots clés libres

Diabète

Migration cellulaire

Secretome

Cicatrisation

Cellules souches issues du tissu adipeux

Secretome

Cell migration

Wound healing

Diabetes

Adipose derived stem cells

Résumé

Les diabètes de type 1 et 2 sont à l’origine de complications chroniques multiples liées à un excès de sucre dans le sang. L’une des complications dont souffrent 15 à 25% des patients diabétiques concerne les ulcérations du pied diabétique (DFU), une maladie liée à un retard de cicatrisation des plaies et des blessures et qui est responsable d’environ 8000 amputations par an en France.Plusieurs études mettent en avant les capacités thérapeutiques des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSCs) pour aider la cicatrisation en les intégrant par exemple dans des pansements. Au-delà des cellules, les sécrétions des ADSCs elles-mêmes joueraient un rôle clé par leur action dans la cicatrisation, ce qui ouvre des perspectives prometteuses de traitements contre le DFU utilisant le sécrétome seul à partir d’ADSCs.Afin de mieux comprendre l’impact d’un environnement diabétique et DFU sur la cicatrisation, nous avons développé un modèle in vitro de sécrétions diabétiques et de peau reconstruite, dans l’objectif d’identifier les effecteurs négatifs de la cicatrisation. Le travail de thèse s’est déroulé sous 3 axes : (i) réaliser des cultures d’ADSCs de pied du diabétique à partir de cohortes de patients et d’ADSCs non pathologiques, en 2D ou 3D (sphéroïdes) afin d’analyser leur sécrétome différentiel par protéomique; (ii) étudier l’influence des sécrétions d'ADSCs de pied du diabétique sur la migration de fibroblastes et (iii) mesurer l’impact de la nature (pathologique ou non) des ADSCs sur la structure globale de la peau et sur sa vascularisation en les introduisant dans un modèle d’organoïde de peau reconstruite.L’analyse des sécrétions en LC-MS/MS a permis d’identifier plus de 650 protéines dans les sécrétions des ADSCs de patients non pathologiques, obèses, diabétiques et DFU et 4 protéines (HMCN1, COMP, FABP3 et ALPL) impliquées dans la régulation de l’inflammation, le remodelage de la matrice extracellulaire ou la thermogénèse ont été observées comme différentiellement abondantes dans les sécrétions d’ADSCs DFU.La possibilité de concentrer, de stimuler et d’étudier la dynamique temporelle des sécrétions d’ADSCs a été évaluée sur des sphéroides 3D et par microfluidique via un renouvellement permanent du milieu de culture mais n’a pas permis, dans notre configuration d’étude du modèle, de montrer un effet significatif du flux par rapport aux conditions statiques.Le modèle de test de blessure, limité dans notre étude à des fibroblastes primaires, n’a pas permis de montrer un ralentissement significatif de la migration sous l’effet des sécrétions DFU, obèses ou diabétiques. Ce modèle pourrait être complété par d’autres paramètres permettant de suivre la migration et la prolifération des cellules endothéliales et des kératinocytes, la modulation de la réponse immunitaire ainsi que l’action antibactérienne.En revanche, l’effet des ADSCs DFU incorporées dans les modèles de peaux reconstruites est plus visible puisque l’on observe une augmentation du développement du réseau endothélial qui apparait plus dense.Ce projet a permis d’approfondir notre connaissance sur le sécrétome des ADSCs obtenues auprès de patients diabétiques et DFU et pourrait à termes déboucher sur des pistes thérapeutiques d’intérêt pour optimiser la cicatrisation des plaies.

Type 1 and type 2 diabetes cause multiple chronic complications related to excess sugar in the blood. One of the complications suffered by 15 to 25% of diabetic patients is diabetic foot ulceration (DFU), a disease linked to delayed wound healing and responsible for approximately 8000 amputations per year in France.Several studies have highlighted the therapeutic capabilities of adipose derived stem cells (ADSCs) to aid wound healing by integrating them into dressings, for example. Beyond the cells, the secretions of ADSCs themselves would play a key role in wound healing, which opens up promising prospects for DFU treatments using the secretome alone from ADSCs.In order to better understand the impact of a diabetic environment and DFU on wound healing, we developed an in vitro model of diabetic secretion and reconstructed skin, with the objective of identifying the negative effectors of wound healing. The work of the thesis was carried out in 3 axes: (i) to perform cultures of diabetic foot ADSCs from patient cohorts and non-pathological ADSCs, in 2D or 3D (spheroids) in order to analyze their differential secretome by proteomics; (ii) to study the influence of ADSCs secretions from diabetic foot on fibroblasts migration and (iii) to measure the impact of the nature (pathological or not) of ADSCs on the global structure of the skin and on its vascularization by introducing them in a reconstructed skin organoid model.By using LC-MS/MS analysis of secretions, we identified more than 650 proteins in ADSCs secretions from non-pathological, obese, diabetic and DFU patients and 4 proteins (HMCN1, COMP, FABP3 and ALPL) involved in the regulation of inflammation, extracellular matrix remodeling or thermogenesis were observed to be differentially abundant in the secretions of DFU ADSCs.The ability to concentrate, stimulate, and study the temporal dynamics of ADSCs secretions was evaluated on 3D spheroids and by microfluidics via continuous renewal of the culture medium but did not, in our model study setup, show a significant effect of flow compared to static conditions.The wounding test model, limited in our study to primary fibroblasts, did not show a significant slowing of migration under the effect of DFU, obese or diabetic secretions. This model could be completed by other parameters allowing to follow the migration and proliferation of endothelial cells and keratinocytes, the modulation of the immune response as well as the antibacterial action.On the other hand, the effect of DFU ADSCs incorporated in reconstructed skin models was more visible since we observed an increase in the development of the endothelial network, which appears denser.This project has allowed us to deepen our knowledge of the secretome of ADSCs obtained from diabetic and DFU patients and could ultimately lead to therapeutic strategy of interest for optimizing wound healing.