Rhéologie multi-échelle du mucus pulmonaire pathologique

Multi-scale rheology of pathological pulmonary mucus

• Auteur / Autrice : Lydia Esteban Enjuto
• Direction : Hugues Bodiguel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Matériaux, Mécanique, électrochimie, génie civil
• Date : Soutenance le 23/06/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Ingénierie - matériaux mécanique énergétique environnement procédés production (Grenoble ; 2008-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire rhéologie et procédés (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Jean-François Berret
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Claude Verdier, Arnaud Bourdin, Gregory Chagnon
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Annie Viallat, Thierry Aubry

Mots clés

Mots clés contrôlés

Expectorations

Rhéologie (biologie)

Poumon -- Maladies

Mots clés libres

Maladies pulmonaires

Rhéologie

Sputum

Rheology

Respiratory disease

Sputum

Résumé

Le mucus pulmonaire joue un rôle crucial dans le système respiratoire en protégeant la santé des voies respiratoires. Le mucus sert de barrière physique qui capture les particules inhalées et les agents pathogènes les empêchant d'atteindre les tissus pulmonaires. L'élimination ultérieure du mucus ainsi que des particules piégées et des agents pathogènes se produit par le battement de structures ressemblant à des cheveux appelées cils qui tapissent les voies respiratoires. Cette clairance mucociliaire évite la colonisation bactérienne et l'infection. Le mucus des maladies muco-obstructives telles que la mucoviscidose et la dilatation des bronches (DDB) est épais et collant. La haute viscoélasticité du mucus pathologique affecte sa capacité à être évacuée efficacement. Par conséquent, le mucus a tendance à rester bloqué dans les voies respiratoires, favorisant les infections chroniques.Cette thèse vise à comprendre les mécanismes impliqués dans la rhéologie des expectorations des patients de mucoviscidose et DDB. Pour atteindre cet objectif, nous avons d'abord développé et publié un protocole robuste pour manipuler et stocker des échantillons d'expectorations avant la rhéométrie. Les expectorations se sont avérés extrêmement sensibles aux températures élevées et aux effets du vieillissement. Au contraire, la congélation et la conservation des échantillons à -80 °C ne présentent aucune influence sur leur rhéologie. De plus, le vortex réduit l'hétérogénéité des expectorations, diminuant la variabilité entre les aliquotes. Nous avons donc approuvé un protocole simple et fiable dans lequel les échantillons peuvent être congelés et conservés à -80°C après élimination de la salive et vortex.Ensuite, nous avons systématiquement mesuré la macrorhéologie des expectorations. Nous avons identifié des caractéristiques rhéologiques distinctes entre les échantillons purulents et mucoïdes, motivant le développement d'une technique indépendante de l'utilisateur basée sur le traitement d'image pour quantifier avec précision la purulence.Premièrement, la concentration solide est corrélée à la purulence et à la rhéologie des expectorations. G* présente une augmentation drastique avec le contenu organique alors que la concentration en sel ne semble pas avoir d'impact significatif sur ses propriétés mécaniques.Deuxièmement, nos observations révèlent des différences entre les échantillons purulents et mucoïdes en ce qui concerne l’inflammation. Les expectorations purulentes présentent une augmentation significative de G* avec un nombre de neutrophiles plus élevé. Cependant, contre-intuitivement, les échantillons mucoïdes présentent une diminution de la viscoélasticité en présence des neutrophiles. De plus, nous avons constaté que le recrutement des neutrophiles n'est pas lié à la quantité globale de bactéries mais plutôt à des colonies bactériennes spécifiques. Les expectorations majoritairement colonisées par les mucoïdes p. aeruginosa ou contenant h. influenzae présentait un nombre de neutrophiles plus élevé, entraînant des expectorations purulentes avec une viscoélasticité prononcée. De plus, nous avons observé que les patients souffrant d'affections pulmonaires sévères et d'un stress critique supérieur à 20 Pa ont des échantillons très purulents.Enfin, nous montrons l'influence significative de la purulence sur la capacité de récupération des crachats suite à un effort important. Bien que tous les échantillons aient connu une diminution de leurs propriétés d'écoulement, la restauration de G* n’est pas complète. Les expectorations purulentes ont montré une réduction de leur G*, tandis que les expectorations mucoïdes ont montré une augmentation. De plus, leur évolution temporelle diffère notablement, les échantillons purulents perdant la moitié de G* dans les 6 premières heures, alors que les expectorations mucoïdes restent inchangées sur 24 heures.

Pulmonary mucus plays a crucial role in the respiratory system by protecting and maintaining the health of the airways and lungs. Mucus serves as a physical barrier that captures inhaled particles and pathogens preventing them from reaching the pulmonary tissues. The subsequent clearance of mucus along with the trapped particles and pathogens, occurs through the coordinated beating of hair-like structures known as cilia which are lining the airways. This mucociliary clearance avoids bacterial colonisation and infection. Mucus from muco-obstructive diseases such as cystic fibrosis (CF) and non-cystic fibrosis bronchiectasis (NCFB) is thick and sticky. The high viscoelasticity of pathological mucus affects its ability to be cleared out of the respiratory tract effectively. Therefore, mucus tends to stay blocked in the airway system promoting bacteria proliferation which can lead to chronic infections.This thesis aims to understand the mechanisms involved in the rheological properties of pulmonary sputum. We have focused on understanding how the rheology of CF and NCFB expectorations correlates to their composition and structure.To achieve this objective we have first developed and published a robust protocol to handle and store sputum samples before rheometry. Sputa has been found to be extremely sensitive to high temperatures and ageing effects. On the contrary, freezing and storing samples at -80 °C presents no influence on the rheological properties of sputa. Moreover, vortexing reduces the heterogeneity of sputum, diminishing the variability between aliquots. We have therefore approved a simple reliable protocol in which samples can be frozen and stored at -80°C after removing the saliva and vortexing.Then we have systematically measured sputum’s macrorheology obtaining insights into the overall flow and deformation properties of sputum. We have identified distinct rheological characteristics between purulent and mucoid samples, motivating the development of a user-independent technique based on image processing to accurately quantify sputum purulence.Firstly, solid concentration is correlated with sputum’s purulence and rheology. G* presents a drastic increase with organic content while the concentration of salt in sputum does not appear to have a significant impact on its mechanical properties.Secondly, our observations reveal differences between purulent and mucoid samples regarding their response to neutrophil count. Purulent expectorations exhibit a significant increase in G* with higher neutrophil counts. However, contra-intuitively, mucoid samples present a decrease in viscoelasticity in the presence of large number of neutrophils. Furthermore, we have found that the recruitment of neutrophils is not linked to the overall quantity of bacteria but rather specific bacterial colonies. Expectorations predominantly colonised by mucoid p. aeruginosa or containing h. influenzae exhibited a higher neutrophil count, resulting in purulent sputum with a pronounced viscoelasticity. Additionally, we have observed that patients with severe lung conditions and a critical stress exceeding 20 Pa tend to have highly purulent samples. Consequently, these severe patients present dark purulent sputum characterized by low flowing capacity, which likely contributes to lung obstruction and the persistence of chronic infections.Finally, we show the significant influence of purulence on the recovery capacity of sputum following large strain. Although all samples experienced a decrease in their flowing properties, the restoration of their viscoelastic behaviour in the linear range is incomplete. Purulent expectorations exhibited a reduction in their G*, while mucoid sputum showed an increase. Furthermore, their temporal evolution differs notably, with purulent samples losing half of G* within the first 6 hours, whereas mucoid expectorations remain unchanged over 24 hours.