Regulators of Sirtuin Type 1 (SIRT1) : a key player in bone alterations and bone marrow stromal cells differentiation capacity in a mouse model of Anorexia nervosa

Identification des régulateurs de la sirtuine de type 1 (SIRT1) : acteur clé de l’altération osseuse et la capacité de différenciation des cellules stromales en situation de déficit énergétique (Anorexie Mentale)

• Auteur / Autrice : Viktorija Avilkina
• Direction : Christophe Chauveau, Olfa Ghali
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie, Médecine et Santé. Aspects moléculaires et cellulaires et de la biologie
• Date : Soutenance le 07/02/2023
• Etablissement(s) : Littoral
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences, technologie et santé (Amiens)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Marrow Adiposity & Bone Lab (Boulogne-sur-mer, Pas-de-Calais) - Marrow Adiposity & Bone Lab - Adiposité Médullaire et Os - ULR 4490
• Partenaire(s) de recherche : Financeur : Hauts-de-France. Conseil régional
• Jury : Président / Présidente : Odile Viltart
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christophe Chauveau, Olfa Ghali, Odile Viltart, Sarah Beck-Cormier, Anne Bouloumié, Alain Guignandon, William Cawthorn, Saïd Kamel
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Sarah Beck-Cormier, Anne Bouloumié

Mots clés

Mots clés contrôlés

Adipocytes

Ostéoblastes

Homéostasie

Ostéoporose

Mots clés libres

Sirt1

Cellules souches stromales

Anorexie Mentale

Sirt1

Bone marrow stromal cells

Anorexia nervosa

Résumé

Le tissu adipeux joue un rôle majeur dans le stockage de l’énergie. Il est localisé à différents endroits : sous cutané, viscéral et médullaire. En effet, ce tissu adipeux médullaire est impliqué dans la régulation de l’homéostasie osseuse, le remodelage osseux (équilibre entre formation et résorption osseuses) et l’hématopoïèse. Un déséquilibre entre formation et résorption osseuses au détriment de la formation entraîne la fragilisation de l’os et la survenue de fractures, qui représentent la mani-festation principale de l’ostéoporose (OP). Une augmentation de l’adiposité médullaire est démontrée dans l’OP liée à l’anorexie mentale. Ce tissu adipeux semble jouer un rôle crucial dans l’altération osseuse. Parmi les arguments soutenant cette hypothèse, notons que les ostéoblastes et les adipocytes médullaires proviennent d’un progéniteur commun, la cellule souche squelettique qui fait partie des cellules stromales (CS), et que plusieurs études ont montré une relation inverse entre ostéogenèse et adipogenèse. Parmi les régulateurs de la différenciation ostéoblastique, plusieurs études ont montré que la sirtuine de type 1 (Sirt), une classe d’enzymes des histones désacétylases, joue un rôle majeur dans le contrôle de la balance ostéogenèse/adipogenèse. En effet, Sirt1 est connue pour ses effets pro-ostéoblastiques et anti-adipocytaires. En ce qui concerne la restriction calorique, il a été montré qu’une restriction prolongée favorise l’activation de Sirt1 et que les patientes anorexiques présentent une diminution du niveau de Sirt1. Afin d’étudier le rôle de cette protéine dans le développement de l’OP associée à l’anorexie mentale, notre groupe a développé un modèle murin mimant de nombreuses conséquences de l’anorexie mentale (modèle basé sur la restriction alimentaire couplée à la séparation « SBA » : Separation Based Anorexia). Ce projet de thèse repose sur l’hypothèse que la diminution de l’expression de Sirt1, dans les cellules stromales, est associée aux altérations osseuses et à l’adiposité médullaire et que le niveau de l’expression de Sirt1 pourrait être lié au degré de sévérité et à la durée du protocole SBA. Nos résultats ont montré que le protocole SBA de 10 semaines a entrainé une diminution significative de l’épaisseur corticale et trabéculaire chez les souris de -12%, -18% et -24% de degré de sévérité. En revanche, ce long protocole n’a pas d’effet sur l’adiposité médullaire. De plus, nous avons montré, que la diminution de l’expression de Sirt1 dans les cellules stromales des souris de -18% et à 10 semaines de protocole SBA, s’accompagne d’une augmentation de l’adipogenèse au détriment de l’ostéogenèse. Contrairement au long protocole SBA (-18%), le protocole court de 4 semaines également à 18% n’a d’effet ni sur les paramètres osseux, ni sur le niveau de l’expression de Sirt1, ni sur la capacité de diffé-renciation des CS montrant que cette durée n’est pas suffisante pour altérer le phénotype osseux, ni pour modifier l’expression de Sirt1 et la différenciation cellulaire.Afin de déterminer les mécanismes moléculaires responsables de la diminution de l’expression de Sirt1, une analyse par RNA-seq des CS de souris SBA à 4 et à 10 semaines de protocole (-18%) a été réalisée. Les données de RNA-seq ont fait l’objet d’une étude préliminaire qui a permis d’identifier quelques gènes potentiellement reliés à la régulation de Sirt1 comme Rb1. La transfection avec un siRNA dirigé contre Rb1 a montré que ce gène n’est pas un régulateur de Sirt1. Enfin, nos résultats ont montré que la diminution de l’expression de l’AMPK (si-RNA) a entrainé une diminution de l’expression de Sirt1 suggérant que cette voie est impliquée dans la régulation de Sirt1. Ceci permettra à court terme une meilleure compréhension de la régulation de l’adiposité médullaire et à moyen terme de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une meilleure prise en charge de l’OP, notamment liée à l’anorexie mentale.

Adipose tissue is an important storage unit of the energy in human body. It is distributed as fat in the body and one of its locations is inside the bone cavity. The bone marrow adipose tissue serves an important role in regulation of bone homeostasis, balance between bone formation and resorption and haematopoiesis. In the severe undernutrition condition like anorexia nervosa, it was demonstrated that bone fracture rate is increased among the diagnosed patients. After studying their bone parameters, it was found that some patients had an increase in bone marrow adipose tissue inside the bone that is associated with bone loss and development of osteoporosis. Bone and fat tissue are coming from the same precursor cells – bone marrow stromal cells (BMSCs), therefore it was hypothesised that the change in stem cell fate decision can be responsible for the development of osteoporosis. Sirtuin of type 1 (SIRT1), a histone deacetylase that is partly regulated by energy balance, was shown to have a pro-osteoblastogenic and anti-adipogenic effects. Interestingly, reduction of caloric consumption activates this protein function and improves whole body metabolic homeostasis, but in anorexic patients with extremely low food consumption SIRT1 level in the bone was shown to be reduced.Therefore, in order to study the function of this protein in bone, a mice model was established in our lab that mimics the consequences of anorexia nervosa. The weight loss in mice (18% from initial weight) was achieved through mice isolation in separate sections of the cage and by time restricted feeding. Increased stress and thermogenesis as well as decrease in food availability time resulted in energy deficiency and weigh loss in mice. We hypothesised that Sirt1 deficit in BMSCs is associated with bone and BMA alterations and could potentially depend on the severity of weight loss and the length of SBA protocol.We studied bone parameters, BMA, BMSC differentiation capacity and Sirt1 expression. Our results demonstrated that 10-week SBA protocols associated with body weight loss (12%, 18%, 24%) induced a significant decrease in bone parameters without any increase in BMA. BMSCs extracted from SBA group (18%) showed a significant decrease in Sirt1 mRNA levels after co-differentiation. Decrease in Sirt1 was associated with an increase in adipogenesis and a reduction of osteoblastogenesis. Inducing a 18% body weight loss we tested short SBA protocol (4-week). We demonstrated that 4-week SBA protocol is not able to induce changes in bone and BMSC differentiation. RNA sequencing was conducted to establish transcriptomic differences within extracted BMSCs between SBA 18% weigh loss mice and control mice, in two different protocol durations. Preliminary analysis of data suggested that in both 10-week and 4-week protocols, reduction in immune system activation and haematopoiesis was observed. Moreover, transcriptomic data allowed us to identify potential regulators of Sirt1 gene, which were further tested using RNA interference. However, one of the candidate genes, Rb1 was shown to not affect Sirt1 expression, therefore further exploration of candidate genes should be conducted. Moreover, we tested the regulatory effect of AMPK on SIRT1, which was previously described in the literature. AMPK activity suppression leaded to the reduction of Sirt1 mRNA expression. Moreover, decrease in AMPK expression using small interference RNA, also resulted in reduced Sirt1 mRNA level. Suggesting that AMPK is involved in the regulation of Sirt1 gene expression.Overall, study of SIRT1 regulatory pathways leads to the improvement of our understanding about the nature of anorexia related bone loss, and potentially leads to the future development of suitable therapies, which might help anorexic patient to recover from consequences of this condition.