Adipocytes médullaires et ostéoporose liée au vieillissement

Medullary adipocytes and age-related osteoporosis

• Auteur / Autrice : Federica Quacquarelli
• Direction : Odile Broux, Antonella Poloni, Aline Clabaut
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie, Médecine et Santé. Aspects cellulaires et moléculaires de la biologie
• Date : Soutenance le 10/02/2023
• Etablissement(s) : Littoral en cotutelle avec Università politecnica delle Marche (Ancône, Italie)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences, technologie et santé (Amiens)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Marrow Adiposity & Bone Lab (Boulogne-sur-mer, Pas-de-Calais)
• Jury : Président / Présidente : David Magne
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Maria Rita Rippo, Xavier Houard, Joëlle Amédée Vilamitjana, Moustapha Kassem
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : David Magne, Maria Rita Rippo, Xavier Houard

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ostéoporose

Reprogrammation cellulaire

Adipocytes

Cellules stromales médullaires

Ostéoblastes

Mots clés libres

Adipocytes

Cellules stromales de la moelle osseuse

Ostéoporose

Ostéoblastes

Transdifférenciation

Modèles cellulaires

Adipocytes

Bone marrow stromal cells

Osteoporosis

Osteoblasts

Transdifferentiation

Cellular models

Cellule stromali midollari

Ostéoblasti

Adipociti

Transdifferenziamento

Modelli cellulari

Osteoporosi

Résumé

Contexte et objectifs : Nos résultats suggèrent que les adipocytes médullaires pourraient contribuer à la perte osseuse. En effet, des expériences de coculture et de milieu conditionné (MC) utilisant des cellules stromales de moelle osseuse humaine d'origine commerciale ont montré que les sécrétions des adipocytes induisaient la conversion des ostéoblastes vers un phénotype de type adipocytaire. Des analyses en immunofluorescence ont démontré la co-expression de marqueurs spécifiques de l'ostéoblaste et de l'adipocyte au sein d'une même cellule, soutenant un phénomène de transdifférenciation. Les objectifs étaient (1) d'identifier les facteurs et mécanismes impliqués dans cette transdifférenciation et (2) de développer des nouveaux modèles cellulaires plus physiologiques pour confirmer ce phénomène. Méthodes : (1) Des analyses protéomiques ont été utilisées pour identifier les protéines sécrétées par les adipocytes potentiellement régulatrices de la différenciation des ostéoblastes. En parallèle, les changements d'expression génique des ostéoblastes induits par le MC adipocytaire ont été identifiés par analyse transcriptomique. Les interactions physiques entre les protéines adipocytaires et les protéines membranaires des ostéoblastes ont été recherchées puis intégrées aux modifications transcriptionnelles détectées dans les ostéoblastes. (2) Des têtes fémorales humaines ont été collectées lors d'une chirurgie de pose de prothèse de hanche et utilisées pour (2a) isoler des ostéoblastes primaires par migration cellulaire, suivie de leur incubation avec le MC adipocytaire, (2b) isoler des adipocytes primaires, par un traitement à la collagénase, suivi de culture en suspension et en 2D, et (2c) développer un modèle de culture d'organe, dont la viabilité a été testée par des essais fonctionnels et histologiques. Résultats : (1) Notre analyse a identifié 271 interactions potentielles de type ligand-récepteur et proposé trois voies de signalisation pouvant être impliquées dans la transdifférenciation des ostéoblastes, les voies PI3K-AKT, JAK2-STAT3 et SMAD. Des expériences de Western Blot ont confirmé l'implication de la voie STAT3 dans cet évènement. (2a) Au travers du nouveau modèle cellulaire développé, nous avons confirmé la transdifférenciation des ostéoblastes primaires après leur incubation avec le MC provenant d'adipocytes d'origine commerciale, marquée par l'augmentation des niveaux d'expression des marqueurs adipocytaires PPARG et Leptine et la diminution du niveau d'expression de l'ostéocalcine, un marqueur ostéoblastique. (2b) La coloration à l'Oil Red O a confirmé l'isolement des adipocytes primaires à partir des biopsies osseuses. Leur MC est également capable d'induire la transdifférenciation des ostéoblastes comme celui des adipocytes d'origine commerciale. (2c) L'adéquation du modèle de culture d'organe sans perte appréciable de viabilité, avec une structure non altérée et la présence de cellules osseuses fonctionnelles, a été démontrée. L'étape suivante consistera à analyser l'effet des produits de sécrétion adipocytaire par l'incubation des explants osseux avec du MC. Conclusions : (1) L'intégration des données provenant de l'analyse du sécrétome adipocytaire et du transcriptome des ostéoblastes représente une approche originale qui nous a permis d'apporter un nouvel éclairage sur la communication entre ces cellules. (2) Les nouveaux modèles utilisant des cellules primaires isolées à partir de biopsies osseuses ont confirmé le rôle joué par les sécrétions des adipocytes dans la transdifférenciations des ostéoblastes. Dans le futur, nous prévoyons d'utiliser les données de microarchitecture osseuse obtenues par microtomographie à rayons X pour évaluer l'existence d'une corrélation entre la réponse des ostéoblastes aux sécrétions adipocytaires et la qualité de l'os dont les cellules sont issues.

Background : Our findings suggested that bone marrow adipocytes may contribute to bone loss. Indeed, coculture and conditioned medium (CM) experiments based on commercial human bone marrow stromal cells showed that adipocyte-secreted factors induced the conversion of osteoblasts towards an adipocyte like phenotype. This event was confirmed by microarray analysis showing an enrichment in the adipocyte gene signature in cocultured osteoblasts. Furthermore, double immunofluorescence staining demonstrated the co-expression of adipocyte and osteoblast specific markers in individual cells, providing evidence for a transdifferentiation event. Purpose : The goals were to (1) find the molecules.and pathways involved in these events and (2) develop celullar models closer to the physiological environment to confirm the transdifferentiation event. Methods : (1) one dimensional LC-MS/MS and label-free quantification were used to compare simulatory and non-simulatory adipocyte culture supernatants and identify adipocyte-secrete proteins potentially regulators of osteoblast differentiation. In parallel, osteoblast gene expression changes indusced by adipocyte CM were identified by transcriptional analysis. Physical interactions between adipocyte proteins and osteoblast membrane protein coding genes were examined using StringDB. Significant pathways leading to osteoblast transdifferentiation were then identified using gene set enrichment analysis. Some selected pathways and statistically relevant proteins were investigated through functional assays. (2) Human femoral heads were collected during hip replacement surgery and processed to (2a) isolate osteoblasts through outgrowth of primary cells, followed by their incubation in CM, (2b) develop organ culture, which viability was tested with functional and histological assays, and (2c) isolate adipocytes, through collagenase treatment followed by ceiling and 2D culture. Results : (1) Our analysis identified a total of 271 physical interactions between adipocyte-secreted proteins and osteoblast membrane protein coding genes and proposed three pathways for their potential contribution to osteoblast transdifferentiation, the PI3K-AKT, JAK2-STAT3 and SMAD pathways. Western Blot experiments confirmed the modulation of STAT3 pathway in the transdifferentiation event. (2a) We used two rounds of outgrowth from trabecular bone fragments to isolate primary cells and displayed a specific osteoblast phenotype, characterized by osteocalcin mRNA expression and mineralization. We confirmed the transdifferentiation of these primary osteoblasts following their incubation with CM from commercial adipocytes as evidenced by the increase in the levels of adipogenic mRNA markers (PPARG and Leptin) and the decrease of osteocalcin mRNA level. (2b) The suitability of the human organ culture model with no appreciable loss of viability, unchanged structure and presence of functional bone cells was demonstrated. The next step will be to culture the explants in adipocyte CM to examine its effect on bone cells. (2c) Oil red O staining confirmed the isolation of primary adipocytes from bone biopsies. Experiments revealed that their CM induced osteoblast transdifferentiation as the one from commercial adipocytes. Conclusions : (1) We provided new insights into the crosstalk between adipocytes and osteoblasts in the bone marrow and demonstrated the powerfulness of our integrative Omics strategy to decipher cell-cell communication events. (2) Our new models based on primary cells isolated from bone biopsies confirmed the role played by adipocyte-secreted factors in the transdifferentiation of osteoblasts. In the future, we plan to compare interdonor phenotype variations and bone microarchitecture data obtained by X-ray microtomography to assess the existence of a correlation between the osteoblast response to adipocyte secretions and the quality of the bone from which the cells are derived.

Background : I risultati ottenuti hanno suggerito la partecipazione degli adipociti del midollo osseo alla perdita ossea attraverso i fattore secreti dagli adipociti, che provocherebbero il transdifferenziamento degli osteoblasti verso un fenotipo simile a quello adipocitico. Obiettivo : (1) Trovare le molecole e pathways coinvolti in questi eventi e (2) sviluppare modelli cellulari simili all'ambiente fisiologico per confermare l'evento di transdifferenziamento. Metodi : (1) LC-MS/MS unidimensionale e quantificazione Label-free sono stati utilizzati per confrontare CM stimolatori e non, forniti dagli adipociti e identificare proteine potenzialmente coinvolte nel transdifferenzialmento. Parallelamente, i cambiamenti di espressione genica degli osteoblasti indotti dal CM sono stati identificati mediante analisi trascrizionale. Le interazioni tra le proteine degli adipociti e i geni codofocanti per le proteine della membrana degli osteoblasti sono state esaminate utilizzando StringDB. Sono stati quindi identificati pathways potenzialmente significativi per il transdifferenziamento degli osteoblasti. Alcuni pathways selezionati e proteine statisticamente rilevanti sono stati testati con dei saggi funzionali. Le teste femorali umane sono state raccolte dopo degli interventi chirurgici di sostituzione dell'anca e lavorate per (2a) isolare gli osteoblasti attraverso outgrowth di cellule primarie, seguita dalla loro incubazione in CM, (2b) sviluppare le organ cultures, la cui vitalità è stata testata con analisi funzionali e istologiche, e (2c) isolare gli adipociti, attraverso il trattamento con collagenasi seguito da ceiling culture e coltura 2D. Risultati : (1) La nostra analisi ha identificato un totale di 271 interazioni fisiche tra le proteine secrete dagli adipociti e i geni codificanti per le proteine della membrana degli osteoblasti e ha proposto tre possibli pathways coinvolti del transdifferenziamento degli osteoblasti : PI3K-AKT, JAK2-STAT3 e SMAD. Gli esperimenti di Western Blot hanno confermato il coinvolgimento di STAT3 nel transdifferenziamento. (2a) Abbiamo utilizzato due cicli migrazione cellulare da frammenti ossei trabecolari per isolare le cellule primarie con uno specifico fenotipo osteoblastico, caratterizzato dall'espressione genica di osteocalcina e dalla pronunciata mineralizzazione. Abbiamo confermato il transdifferenziamento di questi osteoblasti primari dopo la loro incubazione con CM drerivante da adipociti commerciali, un evento evidenziato dall'aumento dell'espressione di marker adipogenici (PPARG e leptina) e dalla ridotta espressione di osteocalcina. (2b) È stata dimostrata la riproducibilità della ceiling culture senza perdita apprezzabile di vitalità , la sua capacità di mantenere una microstruttura invariata con presenza di cellule ossee funzionali. Il promisso passo sarà coltivare gli espianti in adipociti CM per esaminarne l'effeto sulle cellule ossee. (2c) La colorazione Oil Red O ha confermato l'isolamento degli adipociti primari dalle biopsie ossee. Gli esperimenti successivi hanno rivelato che anche il loro CM era in grado di indurre il transdifferenziamento degli osteoblasti, al pari degli adipociti commerciali. Conclusioni : (1) Abbiamo fornito nuove informazioni sulle interazioni tra adipociti e osteoblasti nel midollo osseo e dimostrato la validitià della nostra strategia di integrazione omica per decifrare gli eventi di comunicazione cellulare. (2) I nostri nuovi modelli basati su cellule primarie isolate da biopsie ossee hanno confermato il ruolo svolto dai fattori secreti dagli adipociti nel transdifferenziamento degli osteoblasti. In futuro, prevediamo di confrontare le variazioni del fenotipo inter-donatore con dati di microarchitettura ossea ottenuti mediante microtomografia a raggi X per valutare l'esistenza di una correlazione tra la riposta degli osteoblasti al secretoma degli adipociti e la qualità del'osso da cui derivano le cellule.