Le marqueur de sénescence p16Ink4a dans le développement, l'âge adulte et le vieillissement

The Senescence Marker p16 in Development, Adulthood, and Aging

• Auteur / Autrice : Hasan Safwan Zaiter
• Direction : Kay-Dietrich Wagner, Nicole Wagner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interactions Moléculaires et Cellulaires
• Date : Soutenance le 23/10/2023
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie Valrose (Nice)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Côte d’Azur (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Minoo Rassoulzadegan
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Minoo Rassoulzadegan, Christoph Englert, Bettina Wilm, Isabella Scionti
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christoph Englert, Bettina Wilm

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules hépatiques

Gènes p16

Stades embryonnaires

Cellules endothéliales

Cellules

Vieillissement

Mots clés libres

Sénescence cellulaire

Vieillissement

P16

Fonctions hépatiques

Développement

Cellules endothéliales

Cellular senescence

Aging

P16

Liver function

Development

Endothelial cells

Résumé

Le vieillissement est une caractéristique biologique qui se caractérise par une dégénérescence progressive de la fonction des cellules, des tissus, des organes ou d'un organisme intact en raison de l'accumulation de facteurs environnementaux et de stress avec le temps. Plusieurs facteurs ont été attribués au vieillissement tels que le stress oxydatif, le raccourcissement des télomères, les dommages à l'ADN et surtout, le dépôt de cellules sénescentes. Ce sont des cellules irréversiblement mitotiquement inactives, mais métaboliquement actives. La raison sous-jacente à leur sénescence réside dans les bras extrinsèques et intrinsèques. Le bras extrinsèque est principalement caractérisé par l'expression et le profil sécrétoire connu sous le nom de phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP). Le bras intrinsèque résulte de l'impact de plusieurs gènes censés réguler le cycle cellulaire, tels que les gènes suppresseurs de tumeurs p16Ink4a (p16), p19ARF (p19) et p21. P16 est un suppresseur de tumeur et un régulateur du cycle cellulaire qui a été lié au vieillissement et à la sénescence. Des recherches approfondies ont révélé que l'expression de p16 est significativement augmentée dans les cellules sénescentes, ainsi que lors du vieillissement naturel ou de pathologies liées à l'âge. De ce fait, p16 est considéré comme un biomarqueur spécifique pour détecter les cellules sénescentes et le vieillissement. Alors qu'un rôle potentiel de p19 et p21 a été démontré dans le développement embryonnaire, p16 a été moins bien documenté. Pour étudier le rôle potentiel de p16 dans le développement, nous avons mené une étude d'expression développementale de p16, à côté des suppresseurs de tumeurs p19ARF et p21, et examiné leur expression d'ARN dans le cerveau, le cœur, le foie et les reins de souris au stade embryonnaire, postnatal, adulte et les vieux âges. L'immunohistochimie a été utilisée pour examiner l'expression de P16 au niveau de la protéine. Nous avons constaté que l'expression de p16 était très dynamique dans tous les organes au cours des stades embryonnaire et postnatal, et qu'elle était significativement plus élevée chez les souris âgées par rapport à p19 et p21. De plus, nous avons constaté que l'ARNm et la protéine p16 étaient plus répandus dans les cellules endothéliales hépatiques (CE) que les cellules parenchymateuses chez les souris âgées. Ces découvertes indiquent un rôle possible de p16 dans le développement embryonnaire, ainsi qu'un rôle sélectif potentiel de p16 dans les CE hépatiques.Par conséquent, nous avons cherché à mieux comprendre le rôle de p16 dans les processus biologiques des CE hépatiques. Par conséquent, nous avons utilisé de petites constructions en épingle à cheveux (shRNA) et un vecteur ADNc-GFP p16 transduit via un lentivirus, pour inhiber et surexprimer p16 in vitro, afin d'évaluer la perte et le gain de fonction dans deux types de foie. ECs, ECs vasculaires CD31+ et cellules endothéliales sinusoïdales CD146+ (LSEC). Les cellules ont été isolées du foie par un test de tri magnétique des cellules activées (MACS) à l'aide d'anticorps monoclonaux attachés à des billes magnétiques contre les marqueurs de surface CD31 et CD146. Une séquence non codante et des cellules transduites par un vecteur GFP vide ont été utilisées comme contrôle pour les cellules transduites par shRNA et p16-GFP, respectivement.

Aging is a biological feature that is characterized by gradual degeneration of function of cells, tissues, organs, or an intact organism due to accumulation of environmental factors and stresses with time. Several factors have been attributed to aging such as oxidative stress, telomere shortening, DNA damage and most importantly, the deposit of senescent cells (SnCs). These are irreversibly mitotically inactive, yet metabolically active cells. The reason underlying their senescence lies within the extrinsic and the intrinsic arms. The extrinsic arm is mainly characterized by the expression and the secretory profile known as the senescence associated secretory phenotype (SASP). The intrinsic arm results from the impact of several genes meant to regulate the cell cycle, such as the tumor suppressor genes p16Ink4a (p16), p19ARF (p19) and p21. P16 is a tumor suppressor and cell cycle regulator that has been linked to aging and senescence. Extensive research has revealed that p16 expression is significantly increased in SnCs, as well as during natural aging or age-related pathologies. Based on this fact, p16 is considered as a specific biomarker for identifying SnCs and aging. Whilst a potential role of p19 and p21 has been demonstrated in embryonic development, yet p16 has been less well documented. To investigate p16's potential role in development, we conducted a developmental expression study of p16, beside the tumor suppressors p19 and p21, and examined their RNA expression in the brain, heart, liver, and kidney of mice at embryonic, postnatal, adult, and old ages. Moreover, immunohistochemistry (IHC) was used to examine p16 expression at the protein level. We found that p16 expression was highly dynamic in all organs during embryonic and postnatal stages, and it was significantly more upregulated in old mice compared to p19 and p21. Furthermore, we found that p16 mRNA and protein were more prevalent in liver endothelial cells (ECs) than parenchymal cells in old mice. These findings point to a possible role for p16 in embryonic development, as well as a potential selective role for p16 in liver ECs.Therefore, we aimed at better understanding the role of p16 in biological processes of liver ECs Hence, we used small hairpin (shRNA) constructs and a p16 cDNA-GFP vector transduced via a lentivirus, to knock-down and over-express p16 in-vitro, in order to assess the loss and gain of function in two types of liver ECs, CD31+ vascular ECs and CD146+ sinusoidal endothelial cells (LSECs). Cells were isolated from the liver through magnetic activated cells sorting (MACS) assay using a magnetic bead-attached monoclonal antibodies against CD31 and CD146 surface markers. Non-coding sequence and an empty-GFP vector transduced cells were used as a control for shRNA and p16-GFP transduced cells, respectively.