Développement d'un modèle in vitro pour évaluer l'efficacité de prévention et de traitement des manifestations cutanées provoquées par l'application des mesures d'hygiène dans le contexte de la COVID-19

Development of an in vitro model to assess the effectiveness of prevention and treatment of skin manifestations caused by the application of hygiene measures in the context of COVID-19

• Auteur / Autrice : Manon Barthe
• Direction : Véronique Braud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interactions moléculaires et cellulaires
• Date : Soutenance le 12/10/2023
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de pharmacologie moléculaire et cellulaire (Sophia Antipolis, Alpes-Maritimes)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Côte d’Azur (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Laure-Alix Clerbaux
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Laure-Alix Clerbaux, Nicolas Lebonvallet, Franck Chiappini, Hanan Osman-Ponchet, Paul Hofman
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Laure-Alix Clerbaux, Nicolas Lebonvallet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Covid-19

Inflammation

Peau

Mots clés libres

Peau

Inflammation

Covid-19

Skin

Inflammation

Covid-19

Résumé

La barrière cutanée joue un rôle crucial dans la protection de notre corps contre une multitude d'agents externes. La perturbation de cette fonction barrière a des conséquences graves, augmentant la sensibilité aux infections et maladies dermatologiques. La pandémie de COVID-19, causée par l'infection par le SARS-CoV-2, a entraîné près de 7 millions de décès. Pour pénétrer dans les cellules hôtes, le virus utilise deux voies distinctes : la fusion membranaire et l'endocytose. La première implique l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2), et la protéase transmembranaire à sérine 2 (TMPRSS2), alors que la seconde fait intervenir la liaison à ACE2 ou à des récepteurs alternatifs et les cathepsines.Les mesures recommandées pour prévenir la propagation du SARS-CoV-2, telles que le port de masques, le lavage fréquent des mains et l'utilisation régulière de désinfectants, peuvent altérer la barrière cutanée et potentiellement augmenter le risque de transmission virale. Mais, pour qu'une cellule soit infectée, elle doit être pourvue des récepteurs et cofacteurs du SARS-CoV-2.L'objectif de cette thèse était de vérifier si la peau, notamment en cas de barrière altérée ou de conditions inflammatoires, pouvait constituer une voie d'entrée alternative pour le SARS-CoV-2.Dans un premier temps, nous avons développé un modèle in vitro de peau humaine avec une barrière endommagée en utilisant deux traitements physiques, la dermabrasion avec du papier abrasif (PAD) et le ''tape stripping'' avec du ruban adhésif, et un traitement chimique avec le Sodium Dodécyle Sulfate (SDS). Nous avons adopté une approche holistique intégrant des analyses biophysiques (intégrité membranaire), fonctionnelles (absorption cutanée), histologiques (mesure de l'épaisseur du stratum corneum) et transcriptomiques (marqueurs de la fonction barrière et marqueurs de l'inflammation) pour valider le modèle. Ce modèle in vitro présente bien une barrière cutanée altérée, comme le montre une réduction significative de l'épaisseur de stratum corneum, une augmentation importante de l'absorption cutanée et une altération de l'expression des marqueurs de l'inflammation et de la fonction barrière. Ce modèle permet d'évaluer l'efficacité des produits destinés à réparer les dommages cutanés dans le contexte de la pandémie de COVID-19, et de tester les interactions entre le virus et la peau.Par la suite, nous avons évalué l'expression des récepteurs et cofacteurs du SARS-CoV-2 dans la peau, et leur modulation dans un contexte inflammatoire. Les résultats ont révélé une très faible expression de ACE2 et TMPRSS2, des récepteurs impliqués dans la voie de fusion membranaire. Cependant, en présence d'une inflammation (Poly I:C et interférons), l'expression de ces récepteurs augmente considérablement. D'autre part, nous avons observé une forte expression de CD147, un autre récepteur de SARS-CoV-2 impliqué dans la voie d'endocytose. Ces observations suggèrent que le virus peut utiliser les deux voies d'entrée pour pénétrer dans les cellules de la peau, avec des variations en fonction du contexte inflammatoire. L'utilisation de la protéine spike recombinante a confirmé que la spike peut entrer dans les kératinocytes in vitro. Cependant, nous n'avons pas pu mettre en évidence la réplication du virus SARS-CoV-2 après l'infection des kératinocytes.En conclusion, bien que ce projet ait montré que la peau peut constituer une voie d'entrée alternative pour le SARS-CoV-2, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour confirmer l'existence de cette voie de transmission. Par ailleurs, le nouveau modèle de peau humaine in vitro et les résultats obtenus ouvrent de nouvelles perspectives pour mieux comprendre les interactions entre le virus et la peau, ainsi que pour évaluer l'efficacité des produits visant à réparer les dommages cutanés. Ce modèle in vitro peut être appliqué à d'autres infections virales et ne se limite pas uniquement au SARS-CoV-2.

The skin barrier plays a crucial role in protecting our body against a multitude of external agents. Disruption of this barrier function has serious consequences, increasing susceptibility to infections and dermatological diseases. The COVID-19 pandemic, caused by SARS-CoV-2 infection, has resulted in nearly 7 million deaths. To enter host cells, the virus uses two distinct pathways: membrane fusion and endocytosis. The former involves angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and transmembrane serine protease 2 (TMPRSS2), while the latter involves binding to ACE2 or alternative receptors and cathepsins.The recommended measures to prevent the spread of SARS-CoV-2, such as wearing masks, frequent hand washing, and regular use of disinfectants, may alter the skin barrier and potentially increase the risk of viral transmission. However, for a cell to be infected, it must possess the receptors and co-factors of SARS-CoV-2.The objective of this thesis was to investigate whether the skin, especially when presenting a damaged barrier or inflammatory conditions, could serve as an alternative entry route for SARS-CoV-2.First, we developed an in vitro model of human skin with a damaged barrier using two physical treatments, dermabrasion with sandpaper (PAD) and tape stripping, and a chemical treatment with Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). We adopted a holistic approach integrating biophysical analyses (membrane integrity), functional analyses (cutaneous absorption), histological analyses (measurement of stratum corneum thickness), and transcriptomic analyses (markers of barrier function and inflammation) to validate the model. This in vitro model indeed exhibited an altered skin barrier, as evidenced by a significant reduction in stratum corneum thickness, a marked increase in dermal absorption, and altered expression of inflammation and barrier function markers. This model allows for the evaluation of the efficacy of products intended to repair skin damage in the context of the COVID-19 pandemic and to test interactions between the virus and the skin.Subsequently, we assessed the expression of SARS-CoV-2 receptors and co-factors in the skin and their modulation in an inflammatory context. The results revealed very low expression of ACE2 and TMPRSS2, receptors involved in the membrane fusion pathway. However, in the presence of inflammation (Poly I:C and interferons), the expression of these receptors increased significantly. On the other hand, we observed strong expression of CD147, another receptor of SARS-CoV-2 involved in the endocytosis pathway. These observations suggest that the virus may utilize both entry pathways to infect skin cells, with variations depending on the inflammatory context. The use of recombinant spike protein confirmed the localization of spike protein inside keratinocytes. However, we could not demonstrate the replication of the SARS-CoV-2 virus after infection of keratinocytes.In conclusion, while this project has shown that the skin can serve as an alternative entry route for SARS-CoV-2, further research is needed to confirm the existence of this transmission pathway. Moreover, the new in vitro model of human skin and the obtained results open up new perspectives for a better understanding of interactions between the virus and the skin, as well as for evaluating the efficacy of products aimed at repairing skin barrier damage. This in vitro model can be applied to other viral infections and is not limited solely to SARS-CoV-2.