Régulation de l'échangeur Na[+]/[H+] 1 par les espèces réactives de l'oxygène

The Na[+]/H[+] exchanger 1 activity is regulated by Reactive Oxygen Species

• Auteur / Autrice : Denis Doyen
• Direction : Laurent Counillon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interactions Moléculaires et Cellulaires
• Date : Soutenance le 27/03/2023
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de PhysioMédecine Moléculaire (Nice ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Côte d’Azur (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Michel Lazdunski
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michel Lazdunski, Laura Baciou, Sébastien Roger, Dominique Lagadic-Gossmann, Jacques Levraut
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Laura Baciou, Sébastien Roger

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cystéine

Espèces réactives de l'oxygène et de l'azote

Mots clés libres

Nhe1

Régulation

Espèces Réactives de l'Oxygène

Cystéines

Nhe1

Regulation

Reactive Oxygen Species

Cysteines

Résumé

L'échangeur NHE1 Na[+]/H[+] joue un rôle clef dans la régulation du pH et du volume intracellulaire. Son rôle est paradoxal au cours des phénomènes d'ischémie-reperfusion où son activation provoque une surcharge en sodium et indirectement en calcium ce qui peut provoquer des troubles lors de la reperfusion notamment dans les tissus excitables comme le coeur. Cet échangeur est régulé par le pH intracellulaire, le volume cellulaire et par une multitude de voies de signalisation. Plusieurs études et résultats préliminaires ont indiqué une possible régulation par les espèces réactives de l'oxygène qui sont produites lors de l'ischémie-reperfusion. L'objectif de cette étude est d'analyser par quels mécanismes ces espèces réactives de l'oxygène et en particulier l'anion superoxyde O2.- régulent l'activité de NHE1 et de comprendre quelles régions et quels acides-aminés de NHE1 sont importants pour cette régulation.L'activité de NHE1 wild type a été mesurée en présence de donneurs d'O2.- (Ménadione) ou en inhibition de production d'O2.- (Diphényliodonium (DPI) inhibiteur de la NaDPH oxydase). L'activité NHE1 a été quantifiée par flux de lithium en fonction du pH intracellulaire. La Ménadione a ainsi entraîné une activation de NHE1 tandis que le DPI a diminué l'activité de NHE1, démontrant que NHE1 est donc régulé par O2.-. Cette activation par Ménadione et inhibition par DPI sont perdues chez le mutant Cysless de NHE1 dépourvu de toutes ses cystéines. Les cystéines jouent donc un rôle clef dans la régulation de NHE1 par O2.-. Nous avons ensuite testé l'inhibition par le DPI sur des mutants de NHE1 sur chacune de ses cystéines. Cela a permis d'identifier plus précisément 3 cystéines clefs dans ce mécanisme.Afin d'approfondir les groupements structurels des cystéines potentiellement impliqués dans cette régulation, une analyse des modifications covalentes possibles a été menée incluant la recherche de nitrosylation par biotin switch, la recherche de ponts disulfure par exposition à l'iodoacétamide, et la glutathionylation. Cela a permis de montrer la présence de nitrosylation des cystéines, mais pas de ponts disulfures.Parallèlement, nous avons constaté un profil d'adhésion et de migration très différent des cellules selon le type de mutant cystéine de NHE1 exprimé. Nous avons donc analysé l'expression de protéines d'adhésion et la liaison de NHE1 au cytosquelette. Par coimmunoprécipitation de NHE1 avec le complexe ERM (Ezrine/Radixine/Moesine) nous avons pu montrer que les cystéines de ce transporteur sont cruciales pour sa liaison avec le complexe ERM et donc à l'actine corticale.Cette thèse a donc permis de montrer que l'activité de NHE1 est régulée par l'anion superoxyde O2.- et que cette régulation met en jeu certaines cystéines de NHE1 que nous avons identifiées. Nous avons aussi pu montrer que certaines des cystéines de NHE1 sont cruciales pour l'interaction avec le cytosquelette d'actine et jouent un rôle clef dans l'adhésion et la migration cellulaire. L'ensemble de ce travail identifie une connexion clef entre production d'espèces réactives de l'oxygène, la régulation du pH intracellulaire et la motilité et l'adhésion.

The NHE1 Na[+]/H[+] exchanger plays a key role in regulating pH and intracellular volume. Its role is paradoxical during ischemia-reperfusion where its activation causes an overload in sodium and indirectly in calcium which can cause disorders during reperfusion, particularly in excitable tissues such as the heart. This exchanger is regulated by intracellular pH, cell volume and by a multitude of signaling pathways. Several studies and preliminary results have indicated a possible regulation by reactive oxygen species that are produced during ischemia-reperfusion. The objective of this study is to analyze by which mechanisms these reactive oxygen species and in particular the superoxide anion O2.- regulate the activity of NHE1 and to understand which regions and which amino acids of NHE1 are important for this regulation.The activity of NHE1 wild type was measured in the presence of O2.- donors (Menadione) or in inhibition of O2.- production (Diphenyliodonium (DPI) NaDPH oxidase inhibitor). NHE1 activity was quantified by lithium flux as a function of intracellular pH. Menadione thus caused an activation of NHE1 while DPI decreased the activity of NHE1, demonstrating that NHE1 is therefore regulated by O2.-. This activation by Menadione and inhibition by DPI are lost in the Cysless mutant of NHE1 deprived of all its cysteines. Cysteines therefore play a key role in the regulation of NHE1 by O2.-. We then tested the inhibition by DPI on mutants of NHE1 on each of its cysteines, which made it possible to identify more precisely 3 key cysteines in this mechanism.In order to deepen the structural groups of cysteines potentially involved in this regulation, an analysis of possible covalent modifications was carried out including the search for nitrosylation by biotin switch, the search for disulfide bridges by exposure to iodoacetamide, and glutathionylation. This showed the presence of nitrosylation of the cysteines, but no disulphide bridges.At the same time, we observed a very different adhesion and migration profile of cells depending on the type of NHE1 cysteine mutant expressed. We therefore analyzed the expression of adhesion proteins and the binding of NHE1 to the cytoskeleton. By coimmunoprecipitation of NHE1 with the ERM complex (Ezrin/Radixin/Moesin) we showed that the cysteines of this transporter are crucial for its binding to the ERM complex and therefore to cortical actin.This thesis has therefore made it possible to show that the activity of NHE1 is regulated by the superoxide anion O2.- and that this regulation involves certain cysteines of NHE1 that we have identified. We also showed that some of the cysteines of NHE1 are crucial for the interaction with the actin cytoskeleton and play a key role in cell adhesion and migration. All of this work identifies a key connection between the production of reactive oxygen species, the regulation of intracellular pH and motility and adhesion.