Mécanismes de capture des nanovésicules intracellulaires par Tumor Protein D54

Mechanisms of capture of intracellular nanovesicles by Tumor Protein D54

• Auteur / Autrice : Antoine Reynaud
• Direction : Bruno Antonny
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interactions Moléculaires et Cellulaires
• Date : Soutenance le 22/03/2023
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de pharmacologie moléculaire et cellulaire (Sophia Antipolis, Alpes-Maritimes)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Côte d’Azur (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Gérard Lambeau
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Gérard Lambeau, Bruno Goud, Nathalie Sibille, Florence Besse, Yvon Jaillais
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bruno Goud, Nathalie Sibille

Mots clés

Mots clés contrôlés

Interactions nanoparticule-protéine

Vésicules (cytologie)

Mots clés libres

Vésicules intracellulaires

Alps

Interactions proteiques

Phases liquides

Biocondensats

Intracellular vesicles

Alps

Protein interactions

Liquid phases

Biocondensates

Résumé

Tumor Protein D54 appartient à une famille de 4 protéines, TPD52, 53, 54 et 55, dont le rôle et les fonctions restent inconnus. Cependant, ces protéines sont surexprimées dans de nombreux cancers dont le carcinome du sein, les cancers de la prostate, du poumon et de l'ovaire, d'où l'importance de découvrir leurs fonctions et mécanismes d'action.Dans des conditions physiologiques, TPD54 qui est une protéine très abondante dans de nombreuses cellules, apparait cytoplasmique avec une accumulation périnucléaire aux abords de l'appareil de Golgi. Il a été montré récemment, que cette protéine est associée dans le cytoplasme à des nanovésicules de transport de 30 nm de diamètre (Larocque et al., 2019). Cette taille de vésicules est plus petite que celles déjà connues et issues des manteaux COPI, COPII et de Clathrine (50-100nm). La très petite taille de ces vésicules, ainsi que la spécificité de la liaison à TPD54, nous ont incités à étudier le mécanisme de liaison et plus généralement les propriétés de cette protéine.Premièrement, nous avons élucider le mécanisme par lequel TPD54 est capable de lier des nanovésicules intracellulaires, cela par des approches biochimiques (purification de protéines, flottaison, protéolyse ménagée), biophysiques (dichroïsme circulaire, spectroflurimétrie) et de biologie cellulaire (FRAP, STED). TPD54 se lie à des membranes lipidiques de manière dépendante de la courbure grâce à une région amphipathique étendue dont un motif ALPS Amphipathic Lipid Packing Sensor, motif universel de détection de la courbure membranaire qui fut découvert au laboratoire en 2007. Cette région amphipathique accompagnée de son domaine ALPS est nécessaire et suffisante à la liaison aux nanovesicules intracellulaires et de ce fait, à la distribution subcellulaire de TPD54 (Reynaud et al., 2022).Deuxièmement, nous montrons par microscopie électronique et optique que la surexpression intracellulaire de TPD54 conduit à la formation de biocondensats incluant TPD54, des nanovésicules ainsi que des gouttelettes lipidiques. Nous avons reconstitué ce phénomène avec des éléments purifiés. TPD54 peut se séparer en phases liquides grâce à un domaine de dimérisation coiled-coil antiparallèle et ses régions non structurées, entrainant des nanovésicules et des gouttelettes lipidiques grâce à sa région amphipathique étendue comprenant son domaine ALPS. Nous mettons ici en lumière les régions nécessaires aux différents phénotypes de TPD54 ainsi qu'un probable site de régulation par phosphorylation inhibant son activité de rassemblement des nanovésicules par séparation de phase. Les pistes d'implications physiologiques semblent multiples allant du transport vésiculaire, par sa proximité intracellulaire avec de multiples Rabs et plus particulièrement Rab11a une petite protéine G impliqué dans le recyclage, ou encore sa localisation avec des marqueurs des lysosomes, jusqu'à l'autophagie avec sa proximité avec ATG9, une protéine impliquée dans l'initialisation et la formation de l'autophagosome et l'accentuation des phénotypes de phases liquides lors de stress nutritifs, passant par le stockage dynamique de phospholipides.Il reste à démêler la fonction de ces bio-condensats contrôlés pas une protéine abondante, à la fois présente au Golgi, diffuse dans le cytoplasme, et retrouvée surexprimée dans des cancers. La formation de phases liquides est un phénomène de plus en plus important en biologie cellulaire mais est assez rare dans le cas de phases liquides emprisonnant des vésicules de transport.

Tumor Protein D54 belongs to a family of 4 proteins, TPD52, 53, 54 and 55, whose role and functions remain unknown. However, these proteins are overexpressed in many cancers including breast carcinoma, prostate, lung and ovarian cancers, hence the importance of discovering their functions and mechanisms of action.Under physiological conditions, TPD54, which is a very abundant protein in many cells, appears cytoplasmic with a perinuclear accumulation near the Golgi apparatus. It has recently been shown that this protein is associated with transport nanovesicles 30 nm in diameter in the cytoplasm (Larocque et al., 2019). This size of vesicles is smaller than those already known from the COPI, COPII and Clathrin coats (50-100nm). The very small size of these vesicles, as well as the specificity of the binding to TPD54, prompted us to study the binding mechanism and more generally the properties of this protein.First, we have elucidated the mechanism by which TPD54 binds intracellular nanovesicles, using biochemical (protein purification, flotation, limited proteolysis), biophysical (circular dichroism, spectroflurimetry) and cell biology (FRAP, STED) approaches. TPD54 binds to lipid membranes in a curvature-dependent manner through an extended amphipathic region including an ALPS Amphipathic Lipid Packing Sensor motif, a universal motif for detecting membrane curvature that was discovered in the laboratory in 2007. This amphipathic region accompanied by its ALPS region is necessary and sufficient for binding to intracellular nanovesicles and hence for the subcellular distribution of TPD54 (Reynaud et al., 2022).Second, we show by electron and optical microscopy that intracellular overexpression of TPD54 leads to the formation of biocondensates including TPD54, nanovesicles as well as lipid droplets. We have reconstituted this process using purified elements. TPD54 can segregate in liquid phases through an antiparallel coiled-coil dimerization domain and its unstructured regions, encompassing the extended amphipathic region and ALPS region, which drive the recruitment of nanovesicles and lipid droplets. We highlight the regions necessary for the different phenotypes of TPD54 as well as a probable site of regulation by phosphorylation, which inhibits the assembly of nanovesicles by phase separation. Physiological implications of this mechanisms are several fold, ranging from vesicular transport, through the intracellular proximity to multiple Rabs and more particularly Rab11a, a small G protein involved in recycling, or its localization with lysosome markers, to autophagy with the proximity of TPD54 to ATG9. This protein is involved in the initialization and formation of the autophagosome and the liquid phase phenotype during nutrient stress could help the dynamic storage of phospholipids.The function of the bio-condensates controlled by TPD54, an abundant protein, both present in the Golgi, diffused in the cytoplasm, and found overexpressed in cancers, remains to be discovered. The formation of liquid phases is an increasingly important phenomenon in cell biology but is quite rare in the case of liquid phases trapping transport vesicles.