Développement d'un multi-organe sur puce multi-analyse et temps réel dans le contexte de la régulation glycémique et du diabète de type 2

Design of a multi-analysis and real time multi-organ-on-chip in the context of blood sugar regulation and type 2 diabetes

• Auteur / Autrice : Marie Monchablon
• Direction : Sylvie Renaud, Matthieu Raoux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Electronique
• Date : Soutenance le 19/12/2023
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences physiques et de l’ingénieur (Talence, Gironde ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de l'intégration du matériau au système (Talence, Gironde)
• Jury : Président / Présidente : Guillaume Wantz
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Karim Bouzakri
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christel Vanbesien-Mailliot, Thérèse Leblois

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biocapteurs

Matrices de microélectrodes

Muscles striés

Îlots pancréatiques

Diabète non-insulinodépendant

Mots clés libres

Multi-organe-sur-puce

Diabète

Ilots de Langerhans

Muscles squelettiques

Capteur enzymatique

Matrice de microelectrodes

Multi-organ-on-chip

Diabetes

Islets of Langerhans

Skeletal muscles

Enzymatic sensor

Microelectrodes array

Résumé

Depuis 4 décennies, un modèle intermédiaire entre les traditionnelles approches in vivo et in vitro émerge : les Systèmes MicroPhysiologiques (SMP). Ils sont construits pour recréer différents niveaux de physiologie humaine, du simple organe à leurs interactions. Ils améliorent l’environnement de culture grâce à des microstructures accueillant des modèles d’architecture 3D et multicellulaire, et intègrent des microcapteurs monitorant l’activité cellulaire et leur environnement.Ce nouvel outil d’investigation est d’intérêt pour la recherche fondamentale sur les maladies comme le diabète. Dans le cas de cette maladie incurable, la régulation du glucose sanguin, résultant d’interactions complexes entre les îlots pancréatiques, le foie, les adipocytes et les muscles, est altérée. Un Multi-Organe-sur-Puce (MOsP) est un SMP pouvant reproduire ces interactions, et représente donc un modèle pertinent pour la recherche sur le diabète. En effet, la régulation inter-organe n’est pas entièrement reproduite par les modèles in vitro usuels, et requiert de multiples capteurs, ce qui est éthiquement et techniquement impossible in vivo. Dans le contexte du diabète, il n’existe aucun MOsPs reproduisant l’action des îlots sur les muscles, malgré l’importance des muscles squelettiques dans la régulation glycémique.Cette thèse propose une méthodologie pour construire un MOsP étudiant les interactions d’îlot à muscle dans la régulation glycémique. Les 3 objectifs du MOsP étaient : atteindre des concentrations physiologiques d’insuline grâce à des îlots sécrétant en réponse à une élévation physiologique de glucose, induisant une prise de glucose mesurable par les muscles, et monitorer l’expérience en direct. Pour cela, les investigations ont été menées avec une approche interdisciplinaire, utilisant et confrontant des résultats venant d’expériences biologiques in vitro et de simulations modélisant la biologie et la physique.Ce manuscrit détaille les étapes de la méthodologie, et délivre différents designs pour progressivement construire un MOsP comprenant: une puce microfluidique contenant les cellules et un capteur de glucose connecté directement au flux. Les principales découvertes ont été :- Un milieu et procédure de co-culture entre îlots primaires et LHCN-M2 myotubes ont été démontrés.- Un substrat de culture commun de type MicroElectrodes Array a été trouvé.- Des îlots ont été cultivés en puce microfluidique, et ont présenté une sécrétion d’insuline en réponse au glucose durant des expériences en fluidique. Des myotubes ont pu se différentier en puce, et ont présenté une prise de glucose basale (insuline indépendant).- Une stratégie in vitro-in silico pour dimensionner le MOsP a été développée et implémentée. Un modèle in silico simplifié d’îlot a été développé pour rapidement explorer 2 designs de puce. Des expériences in vitro correspondantes, de sécrétion d’insuline, ont été menées et confrontées aux expériences in silico. Les résultats ont soulevé l’hypothèse que les îlots n’avaient pas une fonctionnalité optimale dans nos petits volumes de culture. La même constatation a été faite concernant les myotubes, où la prise de glucose insuline dépendante a été démontrée en macro volumes, mais en micro volumes, la réponse observée (uniquement à concentration physiologique d’insuline) doit être reproduite avec des expériences plus robustes pour démontrer leur présence.- Un capteur de glucose compatible avec le système microfluidique a été caractérisé à l’aide d’expériences in vitro et in silico.- Un multi-potentiostat a été développé dans la perspective de futures mesures électrochimiques multiples et intégrées.Les bases et perspectives présentées ici permettront d’achever le MOsP îlot-muscle par de futurs travaux. La méthodologie peut aussi être réutilisée pour l’ajout de nouveaux organes (foie, adipocytes) complétant le MOsP, qui permettra de mieux comprendre les dérégulations intervenant dans le diabète de type 2.

Over the past 4 decades, an intermediate model between the traditional in vivo and in vitro approaches has emerged: the MicroPhysiological Systems (MPS). MPS are designed to recapitulate different levels of human physiology, from the single organ to organs crosstalk. They upgrade the culture environment by patterning microstructures hosting 3D and multicellular architecture models and integrate microsensors monitoring cell activity and environment.This new investigation tool is of interest in fundamental research on diseases such as diabetes. In this incurable disease, blood glucose regulation, resulting from a complex organs interplay between the pancreatic islets, the liver, the adipocytes and the muscles, is impaired. A Multi-Organ-on-a-Chip (MOoC) is a MPS that can recapitulate these organs crosstalk and represents a relevant model for diabetes research. Indeed, inter-organ regulations are not recapitulated by usual in vitro models, and deciphering these interactions requires multiple sensors, which is not ethically and technically possible in vivo. In the context of diabetes, MOoCs reproducing the islets to skeletal muscles communication do not exist so far, despite the importance of the skeletal muscles impact on blood glucose, under islets action.In this thesis, we propose a methodology to design a MOoC deciphering islets to muscles interactions in blood glucose regulation. The MOoC objectives were to: (i) attain physiological insulin concentration secreted by islets in response to physiological glucose elevation, (ii) that induces a measurable glucose uptake by the muscle cells, (iii) monitor online relevant parameters. To that end, the investigations were conducted with an interdisciplinary approach, using and confronting results from both in vitro biological experiments and in silico modelling of biology and physics.This manuscript details the methodology steps, delivering different designs for progressive validation toward a complete MOoC that comprises a microfluidic chip with cells and an online glucose sensor. During the MOoC construction, our main findings were the following:- A co-culture medium and procedure for primary islets and LHCN-M2 myotubes were demonstrated.- A common MicroElectrodes Array-based substrate was found suited for co-culture in a single microfluidic chip.- Islets were cultured in microfluidic chips, and presented an insulin secretory response to glucose during fluidic experiments. Myotubes were successfully differentiated in microfluidic chips, and presented a measurable basal (insulin-independent) glucose uptake.- An in silico and in vitro informed MOoC scaling strategy was developed and implemented. A simplified in silico islet model was developed to rapidly explore chip designs. Corresponding in vitro insulin secretion experiments were conducted and confronted to the in silico experiments. Results raised the hypothesis that islets function was sub optimal when cultured in our low volume. Similar observation was made concerning myotubes scaling, where insulin-dependent glucose uptake was demonstrated in macro volumes experiments, but in micro volumes, the observed insulin response (only at physiological insulin concentration) has to be further repeated with improved experiments to explicitly demonstrate its presence.- A glucose biosensor compatible with microfluidic was characterized under different injection protocols, using in vitro and in silico experiments.- A multi-potentiostat was developed in the perspective of multiple and integrated electrochemical sensing in the MOoC.From the grounds and perspectives presented in this thesis, future work can be conducted to further complete this islet-muscle MOoC. The methodology can be re-used and extended in the perspective of adding new organs (liver, adipocytes) in this MOoC in order to better address the interorgan crosstalk deregulations in type 2 diabetes pathophysiology.