L'insertion membranaire de la protéine pro-apoptotique Bax est un processus muti-étapes dépendant de TOM22

Membrane insertion of the pro-apoptotic protein Bax is a TOM22-dependent multi-step process.

• Auteur / Autrice : Akandé Rouchidane Eyitayo
• Direction : Stephen Manon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 01/12/2023
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biochimie et génétique cellulaires (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Jacques Bessoule
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Guénal, Vincent Chaptal, Lisenn Lalier, Lucie Bergdoll
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Isabelle Guénal, Vincent Chaptal

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines membranaires

Synthèse protéique

Mitochondries

Apoptose

Mots clés libres

Bax

Nanodisques

TOM22

Apoptose

Mitochondries

Synthèse protéique in vitro

Bcl-xL

Mitochondria

Bax

Apoptosis

TOM22

Nanodiscs

Cell-free protein synthesis

Bcl-xL

Résumé

L'apoptose est le processus par lequel les cellules animales s'autodétruisent en réponse à un signal de mort (par exemple, des dommages à l'ADN). La voie intrinsèque est contrôlée par les protéines de la famille de Bcl-2. Parmi elles, la protéine multidomaine pro-apoptotique Bax joue un rôle central. Bax est présent dans une conformation inactive dans les cellules non apoptotiques. Après un signal apoptotique, Bax est activé et relocalisé vers la membrane externe de la mitochondrie (MOM), où il s’oligomérise pour former un pore de grande taille qui favorise la libération de plusieurs facteurs apoptogènes (par exemple le cytochrome c), qui contribuent à l'activation en aval des caspases. En solution, Bax est organisé en 9 hélices α. Dans sa conformation soluble, l'hélice α9 hydrophobe est stabilisée dans un sillon hydrophobe formé par les 3 domaines BH de la protéine. Le processus d'insertion et d'oligomérisation de Bax dans la MOM reste mal compris. Contrairement à ses partenaires antiapoptotiques (Bcl-2 et Bcl-xL) qui ont une séquence d'ancrage dans la MOM à leurs extrémités C-terminales, ce même domaine chez Bax est important pour maintenir la forme soluble de la protéine. Il est donc important de comprendre comment Bax perméabilise sélectivement la MOM lorsque l'apoptose est induite. Il a été montré que lorsque l'apoptose est induite, l’adressage de Bax dans la MOM dépend de la présence de TOM22 (une sous-unité du complexe d'importation des protéines mitochondriales TOM). Les mécanismes d’adressage et d’insertion de Bax dans la MOM restent cependant mal connus.Dans ce travail, nous avons mis en place un système acellulaire pour étudier les mécanismes sous-tendant la translocation, l’insertion et l’oligomérisation de Bax dans un modèle membranaire simple, les nanodisques. Nos résultats montrent que l’insertion de Bax dans les nanodisques est un processus multi-étapes impliquant deux changements conformationnels successifs, l’exposition d’un domaine hydrophobe dans l’hélice ɑ1, et le dégagement de l’hélice ɑ9 conduisant à l’insertion de la protéine dans la bicouche lipidique. La bicouche lipidique induit le premier changement conformationnel permettant ainsi l’interaction avec TOM22 qui induit le second changement conformationnel. Des expériences de biochimie et de microscopie électronique à transmission ont montré que ce mode d’insertion conduit à la formation d’un oligomère actif de Bax.Nous avons également mis en évidence un second mode d’insertion de Bax impliquant une co-insertion avec son partenaire anti-apoptotique Bcl-xL sous-forme d’un hétérodimère inactif.Il a été précédemment établi que l’action des molécules BH3 mimétiques utilisées en thérapies anticancéreuses était suffisante pour activer Bax et donc rétablir l’apoptose. Nos données montrent que même après l’action des BH3 mimétiques, la perméabilisation de la MOM par Bax reste dépendante de TOM22, suggérant ainsi que les effets des molécules BH3 mimétiques pourraient être potentialisés par des molécules mimant l’effet de TOM22 sur Bax.

Apoptosis is the process by which animal cells self-destruct in response to a death signal (e.g. DNA damage). The intrinsic pathway is controlled by proteins in the Bcl-2 family. Among these, the pro-apoptotic multidomain protein Bax plays a central role. Bax is present in an inactive conformation in non-apoptotic cells. Following an apoptotic signal, Bax is activated and relocated to the mitochondrial outer membrane (MOM), where it oligomerises to form a large pore that promotes the release of several apoptogenic factors (e.g. cytochrome c), which contribute to the downstream activation of caspases. In solution, Bax is organised into 9 α-helices. In its soluble conformation, the hydrophobic α9 helix is stabilised in a hydrophobic groove formed by the protein's 3 BH domains. The process of insertion and oligomerisation of Bax into MOM remains poorly understood. Unlike its anti-apoptotic partners (Bcl-2 and Bcl-xL) which have an anchoring sequence in the MOM at their C-terminal ends, this same domain in Bax is important for maintaining the soluble form of the protein. It is therefore important to understand how Bax selectively permeabilises MOM when apoptosis is induced. It has been shown that when apoptosis is induced, the addressing of Bax in the MOM depends on the presence of TOM22 (a subunit of the TOM mitochondrial protein import complex). However, the mechanisms by which Bax is addressed and inserted into the MOM remain poorly understood.In this work, we set up a cell-free system to study the mechanisms underlying the translocation, insertion and oligomerisation of Bax in a simple membrane model, nanodiscs. Our results show that the insertion of Bax into nanodiscs is a multi-step process involving two successive conformational changes, the exposure of a hydrophobic domain in helix ɑ1, and the release of helix ɑ9 leading to the insertion of the protein into the lipid bilayer. The lipid bilayer induces the first conformational change allowing interaction with TOM22 which induces the second conformational change. Biochemical and transmission electron microscopy experiments have shown that this mode of insertion leads to the formation of an active Bax oligomer.We also demonstrated a second mode of Bax insertion involving co-insertion with its anti-apoptotic partner Bcl-xL in the form of an inactive heterodimer.It has previously been established that the action of BH3 mimetics used in cancer therapy was sufficient to activate Bax and thus restore apoptosis. Our data show that even after the action of BH3 mimetics, MOM permeabilisation by Bax remains dependent on TOM22, suggesting that the effects of BH3 mimetics could be potentiated by molecules that mimic the effect of TOM22 on Bax.