DLL4 au niveau de la GLIA LIMITANS, un acteur clé de la physiopathologie de la neuro-inflammation

Delta like 4 at the GLIA LIMITANS, a key player of neuro-inflammation pathophysiology

• Auteur / Autrice : Pierre Mora
• Direction : Candice Chapouly
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Cellulaire et Physiopathologie
• Date : Soutenance le 09/11/2023
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie des maladies cardiovasculaires (Pessac, Gironde)
• Jury : Président / Présidente : Aude Panatier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Anne-Cécile Boulay, Carine Ali, Thomas Tourdias
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne-Cécile Boulay, Carine Ali

Mots clés

Mots clés contrôlés

Récepteurs Notch

Astrocytes

Cortex cérébral

Maladies neurodégénératives

Sclérose en plaques

Neuro-inflammation

Mots clés libres

Neuro-Inflammation

Voie NOTCH

Astrogliose

Sclérose en plaque

Unité neuro-Vasculaire

Neuroinflammation

NOTCH pathway

Astrogliosis

Multiple sclerosis

Neuro-Vascular unit

Résumé

Introduction : Au cours de la neuro-inflammation, les astrocytes, qui font partie intégrante de l’unité neuro-vasculaire avec les vaisseaux de la barrière hémato-encéphalique (BHE), subissent des changements morphologiques et moléculaires appelés « astrogliose ». On parle alors d’« astrocytes réactifs » dont le phénotype est complexe avec des effets soit bénéfiques, soit délétères, sur l’intégrité de la BHE. Pour caractériser le transcriptome astrocytaire induit par l'astrogliose en contexte inflammatoire et ainsi mieux comprendre les conséquences qui en découlent au niveau du système nerveux central, le laboratoire a réalisé un séquençage de l'ARN sur des astrocytes humains en culture, quiescents versus réactifs. Ce séquençage a permis d’identifier le gène delta like canonical Notch ligand 4 (Dll4), un ligand de la voie NOTCH, comme étant fortement surexprimé par les astrocytes réactifs in vitro. Cette observation a été vérifiée in vivo sur des biopsies corticales de lésions actives de patients atteints de sclérose en plaques.Objectifs : Notre objectif est d’étudier la contribution de la signalisation DLL4-NOTCH1 aux effets de l’astrogliose en condition neuro-inflammatoire.Méthodes : Dans un premier temps, nous avons développé deux modèles murin d’inhibition génique spécifiquement astrocytaire de Dll4 (souris DLL4ACKO), le premier permettant une inhibition partielle et le second une inhibition totale du DLL4 astrocytaire. Puis dans un second temps, nous avons mis au point un modèle préclinique d’inhibition pharmacologique systémique reposant sur un anticorps monoclonal bloquant dirigé contre DLL4 injecté à des souris sauvages C57BL/6. Le modèle de neuro-inflammation que nous avons utilisé est un modèle murin de sclérose en plaques appelée encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) qui consiste à immuniser l’animal contre sa propre myéline. La taille des lésions, l'inflammation, la démyélinisation et le handicap clinique ont été mesurés afin d’évaluer la gravité de la pathologie. En parallèle, nous avons utilisé in vitro des astrocytes primaires humains incubés avec l’interleukin 1 beta afin de mimer un état inflammatoire et ainsi induire l’astrogliose. Dans ce modèle, l’inhibition de DLL4 est obtenue par traitement avec un petit ARN interférent (siRNA) dirigé contre DLL4.Résultats : In vivo, nous avons observé une diminution de la gravité de la pathologie chez les souris Dll4ACKO proportionnelle au degrés d’inhibition du DLL4 astrocytaire. D’un point de vue clinique, le handicap moteur est moins important chez les souris mutées que chez les souris contrôles. D’un point de vue anatomo-pathologique, ces mêmes animaux présentent une diminution de l’astrogliose, corrélée à une diminution de l'expression astrocytaire du facteur pro-inflammatoire interleukin 6 (IL6), et des facteurs de perméabilité vasculaire, thymidine phosphorylase (TYMP) et vascular endothelial growth factor A (VEGFA). In vitro, nous avons démontré que la signalisation juxtacrine DLL4-NOTCH1 dans les astrocytes réactifs participe au contrôle direct du niveau transcriptionnel d’IL6 et que l’inhibition de cette voie engendre une diminution de la production de TYMP et VEGFA. Enfin, nous avons prouvé que le traitement de souris C57BL/6 avec un anticorps monoclonal dirigé contre DLL4 réduit l’invalidité clinique dans un modèle d'EAE et permet le maintien de l’imperméabilité de la BHE.Discussion : L'ensemble de ces données suggère que DLL4 induit une partie des effets délétères de l’astrogliose durant l’EAE via la promotion de l’inflammation et la perturbation de la structure de la BHE. Ainsi, nous pensons que l’axe DLL4-NOTCH1, dans les astrocytes réactifs en contexte inflammatoire, représente une cible intéressante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la prise en charge des pathologies neuro-inflammatoires comme la sclérose en plaques, pour lesquelles les options thérapeutiques font encore cruellement défaut.

Introduction: During neuroinflammation, astrocytes, which form an integral part of the neurovascular unit with the vessels of the blood-brain barrier, undergo morphological and molecular changes known as "astrogliosis". They take the name of "reactive astrocytes", and have a complex phenotype with either beneficial or deleterious effects on the integrity of the blood-brain barrier. To characterize the astrocytic transcriptome induced by astrogliosis in an inflammatory context, and thus gain a better understanding of its consequences for the central nervous system, the laboratory carried out a RNA sequencing on quiescent versus reactive human astrocytes in culture. This sequencing identified the delta like canonical Notch ligand 4 (Dll4) gene, a ligand of the NOTCH pathway, as being strongly overexpressed by reactive astrocytes in vitro. This observation was verified in vivo on cortical biopsies of active lesions from multiple sclerosis patients.Objectives: Our aim is to study the contribution of DLL4-NOTCH1 signaling to the effects of astrogliosis under neuroinflammatory conditions.Methods: Firstly, we developed a mouse model of astrocytic-specific gene inhibition of Dll4 (DLL4ACKO mice). Secondly, we developed a preclinical model of systemic pharmacological inhibition based on a blocking monoclonal antibody directed against DLL4 injected into wild-type C57BL/6 mice. The neuroinflammation model we used is a mouse model of multiple sclerosis called experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), in which the animal is immunized against its own myelin. Lesion size, inflammation, demyelination and clinical disability were measured to assess the severity of the pathology. In parallel, we used in vitro primary human astrocytes incubated with interleukin 1 beta to mimic an inflammatory state and thus induce astrogliosis. In this model, DLL4 inhibition is achieved by treatment with a small interfering RNA (siRNA) directed against DLL4.Results: In vivo, we observed a reduction in the severity of pathology in Dll4ACKO mice. From a clinical point of view, motor disability was less severe in mutated mice than in control mice. From an anatomical-pathological point of view, these same animals show a reduction in astrogliosis, correlated with a decrease in astrocytic expression of the pro-inflammatory factor interleukin 6 (IL6), and of the vascular permeability factors thymidine phosphorylase (TYMP) and vascular endothelial growth factor A (VEGFA). In vitro, we demonstrated that DLL4-NOTCH1 juxtacrine signaling in reactive astrocytes participates in the direct control of IL6 transcriptional levels, and that inhibition of this pathway results in a decrease in TYMP and VEGFA production. Finally, we have demonstrated that treatment of C57BL/6 mice with a monoclonal antibody directed against DLL4 reduces clinical disability in a model of EAE and maintains the impermeability of the blood-brain barrier.Discussion: Taken together, these data suggest that DLL4 induces some of the deleterious effects of astrogliosis during EAE by promoting inflammation and disrupting the structure of the blood-brain barrier. Thus, we believe that the DLL4-NOTCH1 axis, in reactive astrocytes in an inflammatory context, represents an interesting target for the development of new therapeutic strategies for the management of neuroinflammatory pathologies such as multiple sclerosis, for which therapeutic options are still sorely lacking.