Développement d'outils génétiques pour les mycoplasmes urogénitaux, Mycoplasma genitalium et Mycoplasma hominis

Development of genetic tools for urogenital mycoplasmas, Mycoplasma genitalium and Mycoplasma hominis

• Auteur / Autrice : Jennifer Guiraud
• Direction : Cécile Bébéar
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie - immunologie
• Date : Soutenance le 20/10/2023
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie fondamentale et pathogénicité (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Philippe Lehours
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Béatrice Bercot, Laurent-Xavier Nouvel, Florence Tardy, Charles Cazanave
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Béatrice Bercot, Laurent-Xavier Nouvel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Physiopathologie

Organes génitaux femelles -- Infections

Séquençage à haut débit

Mutagenèse

Mycoplasma

Mots clés libres

Mycoplasma

Typage moléculaire

Mutagénèse

Séquençage haut débit

Mycoplasma

Molecular typing

Mutagenesis

High throughput sequencing

Résumé

Mycoplasma hominis et Mycoplasma genitalium sont deux espèces responsables d’infections génitales et extra-génitales chez l’Homme. M. hominis étant difficilement manipulable sur le plan génétique et M. genitalium étant difficilement cultivable, les recherches concernant leur pathogénicité et leur épidémiologie moléculaire restent limitées.L’objectif de ce travail est le développement d'outils génétiques et génomiques chez les mycoplasmes urogénitaux et se découpe en trois parties : une partie plus fondamentale avec (i) l'amélioration de la transformation chez M. hominis et deux parties plus appliquées concernant (ii) le typage moléculaire et la recherche d'antibiorésistance pour les infections à M. genitalium ; et (iii) le développement du « Whole Genome Sequencing » par la technique de DNA capture pour M. genitalium.Un protocole de transformation avait été développé par le laboratoire pour M. hominis ; nous avons cherché à améliorer l'efficacité de la transformation en développant des dérivés du plasmide pMT85-Tet, mieux adaptés à M. hominis. L'utilisation du promoteur synthétique SynMyco en amont du gène de résistance à la tétracycline dérivé d’un isolat clinique de M. hominis a permis de multiplier l'efficacité de la transformation par 100. Ceci autorise la génération et la caractérisation de banques de mutants et représente un outil majeur pour élucider la pathogénicité de M. hominis. Pour démontrer l'intérêt de cette stratégie, nous avons sélectionné un transformant dans lequel le transposon a été intégré dans le locus codant pour le système de clivage des immunoglobulines MIB-MIP. La caractérisation phénotypique a montré que la souche sauvage possédait un système MIB-MIP fonctionnel, alors que la souche mutante avait perdu la capacité à cliver les immunoglobulines humaines.Le typage moléculaire et la recherche d'antibiorésistance pour les infections à M. genitalium a été réalisé dans deux cohortes : (i) une cohorte d'hommes ayant des relations sexuelles avec des hommes utilisateurs de la prophylaxie pré-exposition contre le VIH (PrEP) ou infectés par le VIH suivis en métropole et (ii) une cohorte de femmes dépistées lors des enquêtes de prévalence menées en métropole et en Outre-mer. Le typage moléculaire basé sur l’analyse du polymorphisme du gène mgpB et l’analyse des motifs répétés en tandem dans le locus MG309 a permis de mettre en évidence les réseaux sexuels de transmission. Ceux-ci différaient en fonction du genre et de la localisation géographique des patients. La recherche des mutations dans le gène de l’ARNr 23S et dans les gènes parC et gyrA a montré que la prévalence de la résistance aux macrolides et aux fluoroquinolones était significativement plus élevée chez les hommes que chez les femmes (respectivement 95,4% vs 14,1% et 30,6% vs 7,2%, p<0,001). Nous avons montré que la diffusion de la résistance était polyclonale. Toutefois, une diffusion clonale de deux souches doublement résistantes a été observée au sein de notre cohorte de PrEPeurs.Enfin, l’objectif de la dernière partie de ces travaux était de développer une technique de séquençage de génome directement à partir d'échantillons cliniques positifs pour M. genitalium afin d’obtenir des données plus exhaustives sur les liens phylogénétiques entre les souches, d’identifier de nouveaux marqueurs génétiques et les mutations liées à la résistance. Pour pallier à l’absence de culture et à la faible charge bactérienne dans les échantillons cliniques, nous avons mis au point une méthode de séquençage haut débit automatisée basée sur la technique de DNA capture permettant d’enrichir l’échantillon en ADN cible.Ces travaux nous ont permis d’améliorer et de développer des outils nécessaires à la compréhension de la physiopathologie des infections à M. hominis et de l’épidémiologie des infections à M. genitalium dans un contexte d’augmentation des infection sexuellement transmissibles résistantes aux antibiotiques.

Mycoplasma hominis and Mycoplasma genitalium are two species belonging to the Mollicutes class. They are both responsible for genital and extragenital infections in humans. Because M. hominis is difficult to manipulate genetically and M. genitalium is difficult to cultivate, research regarding their pathogenicity and molecular epidemiology is limited.The objective of this work was the development of genetic and genomic tools for studying urogenital mycoplasmas and is divided in three parts: a fundamental part with (i) the improvement of transformation in M. hominis; and two more applied parts regarding (ii) molecular typing and antibiotic resistance in M. genitalium infections; and (iii) the development of “Whole Genome Sequencing” by targeted DNA enrichment for M. genitalium.A transformation protocol had been developed by our laboratory for M. hominis. We aimed to improve the transformation efficiency by developing derivatives of the plasmid pMT85-Tetracycline more suited to M. hominis. The use of the SynMyco synthetic promoter upstream of the tetracycline resistance gene sourced from a clinical isolate of M. hominis resulted in a 100-fold increase in transformation efficiency. The generation and characterization of large transposon mutagenesis mutant libraries is thus achievable and will provide insight into M. hominis pathogenesis. We then selected a transformant in which the transposon was integrated into the locus coding the MIB-MIP immunoglobulin cleavage system MIB-MIP. Phenotypic characterization showed that the wild-type strain had a functional MIB-MIP system, whereas the mutant strain had lost the ability to cleave human immunoglobulins.Molecular typing and antibiotic resistance testing for M. genitalium infections was performed in two cohorts: (i) a cohort of pre-exposition prophylaxy (PrEP)-users or HIV-infected men who have sex with men monitored in metropolitan France and (ii) a cohort of women screened during prevalence surveys conducted in metropolitan France and in French overseas territories. Molecular typing based on the analysis of the mgpB gene polymorphism and the analysis of tandem repeats at the MG309 locus highlighted the sexual transmission networks. These networks differed according to the gender and geographical location of the patients. The search for mutations in the 23S rRNA and in the parC and gyrA genes showed that the prevalence of macrolide and fluoroquinolone resistance was significantly higher in men than in women (95.4% vs 14.1% and 30.6% vs 7.2%, p<0.001, respectively). Although the diffusion of antibiotic resistance was polyclonal, a clonal spread of two dual-resistant strains was observed in the cohort of PrEP users.Finally, we aimed to develop a genome sequencing method applied directly to M. genitalium-positive clinical samples with the aim of getting more comprehensive data on the phylogenetic relationships between strains, identifying new genetic markers, and testing for resistance-associated mutations. Given that M. genitalium is a fastidious organism and that the bacterial load is low in clinical samples, we developed an automated high-throughput sequencing method based on the targeted DNA enrichment.This work allowed us to improve and develop the tools necessary to understand the physiopathology of M. hominis infections and the epidemiology of M. genitalium infections in the context of increasing prevalence of sexually transmitted infections and antibiotic resistance.