Contrôle de la distribution de peptides en surface de matériaux pour la différenciation cellulaire

Control of micropatterning of peptides for stem cell differentiation

• Auteur / Autrice : Yujie Zhang
• Direction : Marie-Christine Durrieu
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie et Technologies pour le vivant
• Date : Soutenance le 11/10/2023
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (Bordeaux ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Vincent Humblot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Emmanuelle Laurenceau, Cédric Ayela
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Gaëtan Laroche, Christian Bergaud

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules souches

Implants orthopédiques

Biomatériaux

Mots clés libres

Cellules souches adultes

Ingenierie tissulaire

Fonctionnalisation de surface

Differenciation cellulaire

Microstructuration

Adult stem cells

Tissue engineering

Surface functionalization

Cell differentiation

Micropatterning

Résumé

Les malformations squelettiques sont devenues une menace importante pour la santé humaine dans le monde entier. La recherche dans les biomatériaux et la technologie orthopédique a considérablement accéléré le développement de solutions de réparation osseuse. Dans l’ingénierie du tissu osseux, les matériaux alternatifs traditionnels sont pour la plupart bioinertes. Il est donc difficile pour ces matériaux de correspondre complètement à l'interface osseuse, et ces matériaux interagissent rarement avec les tissus environnants. L'utilisation à long terme de ces matériaux entraîne des symptômes cliniques indésirables tels qu'un rejet in vivo.Imiter la matrice extracellulaire naturelle (ECM) pour mieux comprendre et ainsi permettre le développement de matériaux bioactifs innovants est la stratégie retenue dans ce travail de recherche. En effet, l'ECM fournit un microenvironnement approprié afin que les cellules adhèrent, prolifèrent et se différencient en divers types de cellules fonctionnelles.Dans ce travail, nous avons immobilisé par le biais d’une technologie de pulvérisation différentes distributions de micro et nano-motifs bioactifs (distribution désordonnée de micro-motifs de peptides RGD et/ou de peptides mimétiques de la BMP-2) sur les surfaces de PET afin d'étudier la différenciation de cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSC) vers un lignage ostéoblastique.La fonctionnalisation du PET a été vérifiée par différentes techniques : le test au bleu de toluidine-O (TBO) afin de quantifier la densité de fonctions COOH, la spectroscopie de photoélectrons (XPS) et la spectrométrie de masse à ions secondaires à temps de vol (Tof-SIMS) afin de contrôler les pourcentages atomiques ainsi que les liaisons chimiques. La rugosité de surface de chaque cas a été évaluée par microscopie à force atomique (AFM), tandis que la densité et la distribution des peptides sur la surface du PET ont été évaluées par microscopie à fluorescence.De plus, les hMSC ont été cultivées sur nos surfaces bioactives avec différentes conditions de culture. La différenciation des hMSC a été évaluée en quantifiant l'expression de marqueurs par immunocytochimie : des marqueurs ostéoblastiques (Runx-2, OPN) et des marqueurs ostéocytaires (E11, DMP1 et SOST). Les résultats ont indiqué qu’un greffage homogène de peptides BMP-2 présentait une différenciation ostéogénique plus élevée par rapport à une surface fonctionnalisée de façon homogène par des peptides RGD. Nos résultats ont également mis en évidence que l’immobilisation en surface de PET à la fois de peptides RGD et BMP-2 ont entraîné une surexpression de marqueurs ostéoblastiques en comparaison aux surfaces homogènes fonctionnalisées avec un seul peptide (RGD ou BMP-2). Ce résultat suggère que la présence combinée des peptides RGD et BMP-2 permet d’avoir un effet synergique dans l'amélioration du potentiel ostéogénique des hMSC. Notre travail a permis de démontrer que les surfaces présentant des micro-motifs désordonnées de peptides RGD et BMP-2 entraînent une surexpression de marqueurs ostéoblastiques comparativement aux surfaces homogènes bifonctionnalisées (RGD + BMP-2). Des cellules étoilées, caractéristiques typiques des ostéocytes, ont été observées sur certaines surfaces décorées par des microdomaines de peptides RGD et BMP-2.Ce travail fournit une stratégie innovante, facile d’utilisation, rapide pour diriger la différenciation des hMSC vers un lignage ostéogénique. Ces surfaces peuvent être utilisées comme plateformes de culture cellulaire afin d’étudier les interactions cellules-substrats ou cellules-cellules et développer de nouvelles stratégies sur la réparation tissulaire et les thérapies à base de cellules souches.

Skeletal defects have become a significant threat to human health worldwide. Research in biomaterials and orthopaedic technology has greatly accelerated the development of bone repair solutions. In bone biological engineering, the traditional alternative materials are mostly bioinert. However, it is difficult for these materials to match the bone interface completely, and these materials seldom interact with tissue surrounding tissues. Long-term use of these materials leads to adverse clinical symptoms such as in vivo rejection.Bone tissue provides a safe and effective inspiration for bone regeneration research. Mimicking the natural extracellular matrix (ECM) to influence new bone formation is an effective strategy for this inspiration. ECM provides a suitable microenvironment for cells to adhere, proliferate, and differentiate into various functional cell types.we developed a unique combination of bioactive micro and nanopatterns (randomly micropatterning distribution of RGD and/or BMP-2) on PET surfaces by spray technology to design various morphologies to enhance the hMSC differentiation.In our work, we developed different combinations of bioactive micro and nanopatterns (randomly micropatterning distribution of RGD and/or BMP-2) on PET surfaces by spray technology to design various morphologies to enhance the hMSC differentiation.The activation on the material surface was verified by Toluidin-O blue assay (TBO). The immobilization of peptides on the activated PET was ascertained by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and Secondary ion mass spectrometry (Tof-SIMS). The surface roughness of each case was evaluated by atomic force microscopy (AFM), whereas the peptide density and the peptide distribution on PET surface were assessed by fluorescence microscopy.Furthermore, hMSCs were cultured on our bioactive surfaces with different medium. Subsequently, cell lineage differentiation was evaluated by quantifying the expression of immunofluorescence markers: osteoblast markers (Runx-2, OPN) and osteocyte markers (E11, DMP1, and SOST). The results indicated that the homogeneous grafting of single BMP-2 exhibited a higher osteogenic differentiation compared to RGD. Covalently immobilizing and uniformly distributing mixed RGD and BMP-2 peptides on the PET surface (PET-MIX) resulted in a higher osteogenic effect compared to grafting single peptides. This finding suggests that the combined presence of RGD and BMP-2 peptides may have a synergistic effect in enhancing the osteogenic potential of hMSCs. We showed that disordered micropatterned surfaces with RGD and BMP-2 led to a higher osteoblast marker expression than surfaces with a homogenously dual peptide conjugation. Stellate cells, which are typical features of osteocytes, were observed on the surface of some PET-Spray samples. This demonstrates the potential of disordered ligand scrambling distribution to promote osteocyte differentiation.To summarize, we reported a rationally bioinspired coating with intrinsic biochemical cues that provides a suitable environment for bone regeneration. This work provides a robust strategy for directing MSC differentiation into an osteogenic lineage, which can be utilized as a potential cell culture platform to understand cell–substrate or cell–cell interactions, further developing tissue repair and stem cell-based therapies.