Physiological membrane dynamics of oligodendrocytes

Etude physiologique des dynamiques membranaires des oligodendrocytes

• Auteur / Autrice : Mélody Labarchède
• Direction : Arne Battefeld
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 04/05/2023
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Neurodégénératives
• Jury : Président / Présidente : Pascal Branchereau
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pascal Branchereau, Maria Kukley, Brahim Nait-Oumesmar, Nathalie Sol-Foulon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Maria Kukley, Brahim Nait-Oumesmar

Mots clés

Mots clés contrôlés

Canaux potassiques

Homéostasie

Myéline

Oligodendrocytes

Mots clés libres

Oligodendrocytes

Myéline

Homeostasie ionique

GEVI

Dynamiques membranaires

Capture du potassium

Oligodendrocytes

Myelin

Ion homeostasis

GEVI

Membrane dynamics

Potassium buffering

Résumé

Les neurones et les cellules gliales interagissent ensemble dans le cerveau, cependant, nous n’avons pas encore une complète connaissance de la physiologie neuronale et gliale ni même de leur interaction au niveau moléculaire. Les oligodendrocytes produisent les gaines de myéline qui s’enroulent autour de l’axone du neurone. Cette interaction engendre une propagation rapide et précise des potentiels d’action qui est nécessaire pour la perception, l’apprentissage et la mémoire. La physiologie de la myéline est encore méconnue au vu des limitations techniques de mesure par électrode qui ne permettent pas d’enregistrement direct de la gaine de myéline. Cependant, un certain nombre de canaux ioniques comprenant plusieurs canaux potassiques et calciques ont été localisés sur la myéline. Fonctionnellement, ces canaux ioniques pourraient contribuer au maintien des gaines de myéline et à la recapture du potassium qui est relargué dans le milieu extracellulaire durant l’activité neuronale. Afin d’étudier la physiologie de la gaine de myéline, nous avons mis en place une stratégie d’imagerie permettant de mesurer visuellement soit les variations de concentration en ion potassium, soit le changement de voltage dans la myéline pendant le repos et l’activité neuronale. Le but étant d’identifier les changements physiologiques d’ion et caractéristiques membranaires de la myéline durant la décharge neuronale. Pour cela, nous avons injecté in vivo dans le cortex somatosensoriel de souris des virus adéno associé (AAV) permettant l'expression soit du senseur potassique GINKO1, soit du senseur sensible au voltage ASAP3, et ce uniquement dans les oligodendrocytes grace à un promoteur spécifique. Cinq semaines après les transfections, des tranches aigues de cerveau ont été préparées pour étudier ex vivo les variations de voltage et de potassium intracellulaire dans les oligodendrocytes avec des techniques d'imagerie live. Grace à l’épifluorescence, des oligodendrocytes seuls ont pu être imagés durant la stimulation neuronale. Bien que GINKO1 ait été exprimé dans les oligodendrocytes matures, la fluorescence était plus perceptible au niveau du soma que dans la myéline. En réponse à la stimulation électrique, pas de variation de concentration en ion potassium n’a été détectée et enregistrée, potentiellement dû à une saturation du senseur. De plus, des expériences en culture n’ont pas permis d’améliorer le signal du senseur confirmant sa faible sensibilité ou la saturation dans ce système expérimental. Suite à ces résultats, nous avons étudié le changement de voltage dans les oligodendrocytes en utilisant le senseur ASAP3. Ce senseur membranaire, présent au niveau du soma et des gaines de myéline fait de lui un outil adapté pour étudier la physiologie de la myéline. Nos résultats indiquent que la membrane de la myéline est dépolarisée pendant l’activité neuronale, elle ne serait donc pas passive contrairement à ce qui a été précédemment assumé. Les résultats des expériences pharmacologiques ont suggéré que le relargage des ions potassium par les neurones et l’absorption du potassium par les oligodendrocytes engendrent des changements de voltage au niveau de la myéline. Nous avons émis l’hypothèse que la dépolarisation est induite par l’absorption du potassium par les canaux Kir et notamment par la sous-unité Kir4.1 qui a été proposée comme ayant un rôle dans la capture du potassium extracellulaire. Ainsi, nous avons étudié les changements de voltage membranaire de la myéline dans une souris transgénique avec la délétion des canaux Kir4.1 oligodendrocytaires. Pour conclure, nous avons observé un changement de voltage membranaire au niveau de la myéline pendant un potentiel d’action qui est provoqué par les canaux Kir de la myéline. Ces résultats ont montré que les senseurs sensibles au changement de voltage sont des outils intéressants pour étudier les propriétés physiologiques de structures cellulaires inaccessibles avec des techniques classiques.

All neurons and glial cells in the brain interact with each other, but we still have an incomplete understanding of neuronal and glial physiology and their interaction on the subcellular level. Neuronal axons can be wrapped by myelin that is produced by oligodendrocytes. This cellular specialized cell-cell unit ensures fast and accurate propagation of action potentials and is needed for perception, learning and memory. The physiology of the myelin sheath is almost completely unknown and technical limitations of electrode-based measurements do not allow direct recordings at the oligodendrocyte myelin sheath. However, a number of ion channels including several potassium and calcium channels have been proposed to be localized in myelin. Functionally, ion channels in myelin could contribute to maintaining the myelin sheath or could aid in removing potassium ions that are released into the extracellular space during neuronal activity. To investigate the physiology of the myelin sheath, we implemented an imaging strategy that allows to optically measure either potassium ions or voltage changes in myelin during rest and neuronal activity, with the aim to identify physiological ion and membrane changes of the myelin membrane during neuronal firing.To this end, we employed a strategy that allowed in vivo transfection of oligodendrocytes using a viral construct with an oligodendrocyte specific promoter. After in vivo transfection of oligodendrocytes in the somato-sensory cortex with an adeno-associated virus (AAV), oligodendrocytes expressed either the genetically encoded potassium sensor GINKO1 or the genetically encoded voltage sensor ASAP3. Five weeks after transfection acute brain slices were prepared of the mouse somatosensory cortex and oligodendrocytes studied with a live imaging approach. Using epifluorescence, single oligodendrocytes were imaged at 192 Hz during extracellular neuronal stimulation. While GINKO1 was expressed in oligodendrocyte cell bodies GINKO1 fluorescence was not detectable in the myelin processes. In response to electrical stimulation no potassium changes were recorded, presumably as the sensor was saturated. Additional in vitro cell culture experiments did not change sensor fluorescence confirming low sensitivity or saturation in these experimental systems.We next investigate oligodendrocyte voltage changes using ASAP3. The membrane localized sensor was present in cell bodies and the myelin processes thus allowing further investigation of myelin physiology. We here found that the myelin membrane is depolarized during neuronal firing and is thus not passive as previously assumed. Pharmacological experiments suggested that neuronal potassium extrusion and oligodendrocytic potassium uptake underly the recorded myelin voltage changes. We hypothesized that this depolarization is induced by potassium uptake through Kir4.1 channels, thus we next investigated myelin membrane changes in an oligodendrocyte specific Kir4.1 knock-out. In conclusion, we show in my thesis a voltage change of the myelin membrane during action potentials that is driven by Kir channels in myelin. These experiments show that genetically encoded sensors are a useful tool to study physiological properties of cellular structures that are inaccessible by classical techniques.