Radiosensibilisation du glioblastome par un excès de porphyrines

Glioblastoma radiosensitization by porphyrin excess

• Auteur / Autrice : Charles Dupin
• Direction : Sandrine Dabernat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Cellulaire et Physiopathologie
• Date : Soutenance le 23/03/2023
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut d'oncologie de Bordeaux (2022-....)
• Jury : Président / Présidente : Bertrand Liagre
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sandrine Dabernat, Éric Chevet, Céline Didelot, Hervé Seznec
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Bertrand Liagre, Éric Chevet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Porphyrines

Photothérapie

Radiothérapie

Radiosensibilisation

Glioblastome

Mots clés libres

Glioblastome

Radiosensibilisation

Radiothérapie

Photothérapie

Porphyrine

5-ALA

Glioblastoma

Radiosensitization

Radiotherapy

Phototherapy

Porphyrin

5-ALA

Résumé

Introduction Le glioblastome, tumeur cérébrale fréquente présente un mauvais pronostic avec une survie médiane autour de 14 mois. L’acide 5-amino-lévulinique (5-ALA), précurseur de la voie de biosynthèse de l’hème entraine une accumulation de protoporphyrine IX (PpIX) dans les cellules du glioblastome. PpIX est un photosensibilisant connu et nous proposon de l’utiliser comme radiosensibilisant.ObjectifCe travail a évalué l’intérêt d’une sensibilisation de la radiothérapie par l’excès de porphyrines induit par le 5-ALA dans des modèles de cellules dérivées de tumeurs, en culture et dans un modèle de xenogreffe orthotopique. L’effet radiosensibilisant du 5-ALA a été évalué sur des lignées cellulaires, en radiothérapie à haute et basse énergie et en photothérapie. Enfin, l’effet Cerenkov et son interaction avec la PpPIX ont été recherchés sur un accélérateur de haute énergie.Matériel et méthodeNous avons utilisé des lignées P3, GG6 et GG16 dérivées de tumeurs. Le 5-ALA était mis au contact 4h avant les traitements pour les sphéroïdes (à 1mM) ou les souris (à 100mg/kg en intra péritonéal). La taille des sphéroïdes était estimée par seuillage semi-automatique sur ImageJ. Les souris immunodéficientes RAGγ2C−/− étaient implantées en intra-cérébral par 5 sphéroïdes P3 transfectés par la luciferase. La croissance tumorale murine était quantifiée par bioluminescence après injection de D-Luciferine. La radiothérapie était réalisée sur l’encéphale à 220kV et en cas de haute énergie à 6 ou 18MV. La photothérapie était réalisée à 440nm.RésultatsNous avons évalué la croissance et la taille tumorale après différents schémas de radiothérapie encéphalique multifractionnée avec ou sans 5-ALA. Un schéma de fractionnement de 5 × 2 Gy, 3 fois par semaine a entraîné une survie intermédiaire [48-62 jours] par rapport à 0 Gy [15-24 jours], 3 × 2 Gy [41-47 jours] et 5 × 3 Gy [73-83 jours](n=5 souris/groupe). La survie a été corrélée à la croissance tumorale. La croissance tumorale et la survie étaient similaires après des irradiations de 5 × 2 Gy, indépendamment du traitement au 5-ALA (groupe RT (53-67 jours), groupe RT+5-ALA (40-74 jours), HR = 1,57, p = 0,24) (n=11 souris/groupe). La croissance et la survie des sphéroïdes P3 en kV étaient diminuées par la radiothérapie in vitro, inchangées par le prétraitement au 5-ALA, confirmant les résultats in vivo. Sur d’autres lignées dérivées de glioblastome, GG6 et GG16, il n’y avait pas de radiosensibilisation par le 5-ALA. D’autres lignées cellulaires de carcinome (HT29-HT116-A431) et de mélanome (A375) n’étaient par sensibilisées par l’accumulation de porphyrines. Comme le photothérapie sur les cellules P3 était efficace sur les cellules adhérentes (4,7% de cellules survivantes à 1J) et dans une moindre mesure sous forme de sphéroïdes (77,6% de cellules survivantes à 20J), nous avons testé la radiothérapie à haute énergie connue pour produire de l’effet Cerenkov. Néanmoins, le 5-ALA n’entrainait pas sensibilisation des P3 irradiées à haute énergie (en MV) sous forme adhérente ou en sphéroïdes.Sur le plan physique, on a pu montrer un léger effet Cerenkov sur une machine de traitement clinique. Cet effet était plus haut avec des électrons de haute énergie (20MeV) qu’avec des photons en MV. A 20MeV, le signal spectroscopique d’un milieu contenant de la PPIX était modifié par absorption-émission de la PPIX.ConclusionNotre étude montre pour la première fois que dans un modèle tumoral préclinique pertinent pour le glioblastome humain, traité comme en routine clinique, l'administration de 5-ALA, bien que conduisant à une accumulation importante de PpIX, ne potentialise pas la radiothérapie. La radiothérapie à haute énergie ne semble pas suffisante pour produire suffisamment d’effet Cerenkov pour avoir un effet de photothérapie.

Introduction Glioblastoma is a common brain tumor with a poor prognosis and 14 months of median survival. Five-Amino-Levulinic Acid (5-ALA) is a precursor of heme biosynthetic pathway that leads to an accumulation of protoporphyrin IX (PpIX) in glioblastoma cells. PpIX is a known photosensitizer, and we proposed to use it as a radiosensitizer.ObjectiveThis work evaluated the radiosensitization of glioblastoma by 5-ALA-induced porphyrin accumulation, in vitro and in orthotopically xenografted patient-derived tumor cells. The sensitizing effect of porphyrins was evaluated in cell lines, with high and low energy radiotherapy and with phototherapy. Finally, we investigated the PpIX fluorescence-induced by the Cerenkov effect produced with a high energy radiotherapy accelerator.Material and methodWe used the patient-derived P3, GG6 and GG16 tumor cell lines. 5-ALA was delivered 4h before irradiation for spheroids (at 1mM) or mice (at 100mg/kg intraperitoneally). Spheroid size was determined by semi-automatic thresholding on ImageJ. RAGγ2C-/- immunodeficient mice were implanted orthotopically with 5 luciferase-transfected P3 spheroids. Tumor growth was quantified by bioluminescence after injection of D-Luciferin. Radiotherapy was performed on the brain at 220kV (low energy) and with 6-18MV (High energy). Phototherapy was performed at 440nm.ResultsWe evaluated the xenotransplanted P3-derived tumor growth and tumor burden after different regimens of encephalic multifractionated radiation therapy with or without 5-ALA. A fractionation scheme of 5 × 2 Gy three times a week resulted in intermediate survival [48–62 days] compared to 0 Gy (15–24 days), 3 × 2 Gy (41–47 days) and, 5 × 3 Gy (73–83 days). Survival was correlated to tumor growth. Tumor growth and survival were similar after 5 × 2 Gy irradiations, regardless of 5-ALA treatment (RT group (53–67 days), RT+5-ALA group (40–74 days), HR = 1.57, p = 0.24). Spheroid growth and survival were diminished by radiotherapy in vitro, unchanged by 5-ALA pre-treatment, confirming the in vivo results. The analysis of two additional stem-like patient-derived cell lines GG6 and GG16 confirmed the absence of radiosensitization by porphyrin accumulation. Cell lines from carcinomas (HT29-HT116-A431) and melanoma (A375) cell lines were not radiosensitized after 5-ALA treatment. As porphyrin accumulation did induce photoxicity on P3 cells with higher efficiency on adherent cells (4.7% of cells surviving at 1J) than on spheroids (77.6% of cells surviving at 20J), we tested high energy radiotherapy, known to induce the Cerenkov effect. However, MegaVoltage irradiation did not radiosensitize adherent or spheroidal P3 cells pre-treated with 5-ALA. Physical experimentations showed a slight Cerenkov effect in clinical settings. It was higher with high-energy electrons (20MeV) than with MegaVoltage photons irradiation. With 20MeV, the spectroscopic signal was modified in a medium containing PPIX by absorption-emission of PPIX.ConclusionOur study shows for the first time that in a preclinical tumor model relevant to human glioblastoma, treated as in clinical routine, 5-ALA administration, although leading to significant PpIX accumulation, does not potentiate radiotherapy. High voltage radiotherapy does not seem sufficient to produce enough Cerenkov effect to induce phototherapy.