Optimisation de la préparation des greffons hématopoïétiques pourla thérapie cellulaire : Effets combinés de l'acide alpha lipoïque et de l’inhibition de la voiec-Jun N-Terminal kinase sur les processus d'amplification et de différenciation ex vivodes cellules souches hématopoïétiques

Optimization of hematopoietic graft preparation forcell therapy : Combined effects of alpha lipoic acid and pathway inhibitionc-Jun N-Terminal kinase on ex vivo amplification and differentiation processeshematopoietic stem cells

• Auteur / Autrice : Mathilde Huart
• Direction : Philippe Brunet de la Grange
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Cellulaire et Physiopathologie
• Date : Soutenance le 15/03/2023
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de génétique de maladies rares : pathologie moléculaire, études fonctionnelles et banques de données génétiques. Inserm U 827
• Jury : Président / Présidente : François Moreau-Gaudry
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : François Moreau-Gaudry, Thierry Jaffredo, Françoise Pflumio, Aurélie Bedel
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Thierry Jaffredo, Françoise Pflumio

Mots clés

Mots clés contrôlés

Thérapeutique cellulaire

Cellules sanguines

Greffe

Cellules souches hématopoïétiques

Mots clés libres

Expansion

Greffe

Cellules souches hématopoïétiques

Sang périphérique

Auto-renouvellement

Régulation moléculaire

Hematopoietic stem cells

Self-renewal

Graft

Expansion

SteState peripheral blood

Molecular regulation

Résumé

Les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) sont des cellules très primitives à l’origine de toutes les cellules sanguines matures nécessaires à l’homéostasie de l’organisme par des fonctions immunitaires, de transport d’oxygène et d’hémostase. Les CSHs sont caractérisées par leurs capacités d’autorenouvèlement et de multipotence qui leur permettent de maintenir un pool de cellules indifférenciées tout au long de la vie assurant les besoins en cellules matures. Ces deux caractéristiques sont également essentielles dans le cadre de traitements par thérapie cellulaire de certaines hémopathies (leucémies) et nécessitant l’infusion de greffons hématopoïétiques. La composition de ces greffons est alors très importante, et doit comprendre, une grande quantité de cellules dites « progénitrices » qui vont se différencier rapidement et assurer la survie du patient à court-terme, et un nombre suffisant de CSH pour régénérer une hématopoïèse efficace et durable pour assurer la survie du patient à long-terme. Dans certains cas, afin d’assurer une quantité suffisante de cellules progénitrices, le greffon doit subir une étape d’expansion ex vivo qui présente cependant l’inconvénient majeur de la perte des CSH par différenciation au cours de leur division en culture. Conceptuellement, les CSHs peuvent s’auto-renouveler selon deux modes différents : le mode asymétrique qui va initier la génération d’une cellule souche et d’une cellule progénitrice plus différenciée, et le mode symétrique qui va permettre la génération de deux cellules souches filles fonctionnellement identiques à la cellule mère. L’étude et la compréhension de ces deux mécanismes sont essentielles pour les connaissances en recherche fondamentale, mais aussi dans le contexte de l’expansion des greffons ex vivo. C’est pourquoi les travaux réalisés lors cette thèse ont eu pour but d’optimiser les protocoles d’expansions ex vivo grâce à l’utilisation de molécules montrées comme efficaces dans le maintien et l’amplification des CSHs et d’analyser la population enrichie en CSHs obtenue, par une étude transcriptomique en single cell. Ces différentes analyses ont servi à mettre en lumière les mécanismes, liés à l’autorenouvèlement et au maintien des capacités souches, mis en jeux lors de l’amplification ex vivo des cellules primitives. Concernant la première partie, nous avons montré que l’addition d’un inhibiteur de la C-Jun N-terminal Kinase (le JNK-IN-8 = IN8) et d’une molécule anti-oxydante (L’acide alpha lipoïque = ALA) au milieu de culture pendant 12 jours, permettait une expansion 5 fois supérieurs des cellules primitives (caractérisées par la présence de l’antigène membranaire CD34) comparativement aux cultures contrôles. De plus, le pool de cellules CD34+ générées en présence de la combinaison IN8+ALA, permettait une augmentation significative de la greffe et de la reconstitution hématopoïétique humaine dans des souris immunodéficientes 16 semaines après la transplantation. Ces résultats nous ont permis d’émettre l’hypothèse que la combinaison IN8+ALA amplifiait le nombre de CSHs pendant la phase d’expansion, potentiellement en favorisant l’autorenouvèlement par division symétrique. La deuxième partie de ces travaux s’est concentrée sur l’étude des mécanismes et des voies de signalisation régulés pendant l’amplification des cellules CD34+ en présence de IN8 et/ ou ALA. Nous avons donc réalisé une étude approfondie du transcriptome des cellules CD34+ : fraichement isolées, après 6 heures de culture avec ou sans les différentes molécules seules et en combinaison, ainsi qu’au bout des 12 jours de culture en présence de la combinaison IN8+ALA. Les résultats ont montré une augmentation de l’expression des gènes liés au dynamisme et au maintien de l’intégrité du cytosquelette, une diminution des gènes liés à la différenciation ainsi qu’une augmentation des gènes liés au maintien des capacité souches, notamment par l’activation de la voie WNT/β-catenin connue pour ces effets.

Haematopoietic stem cells (HSCs) are very primitive cells at the origin of all mature and functional blood cells necessary for the homeostasis of the organism and ensuring immune, oxygen transport and haemostasis functions. HSCs are characterised by their capacity for self-renewal and multipotency, allowing the maintenance of a pool of undifferentiated cells , which ensures the production of mature blood cells throughout life. These two characteristics are also essential in the context of cell therapy of some haematological diseases such as leukaemia requiring the infusion of haematopoietic grafts. The composition of these grafts is then very important, and have to be composed of (i) a large quantity of so-called "progenitor cells" which differentiate rapidly and ensure the short-term survival of the recipient, and (ii) a sufficient number of HSCs able to regenerate an efficient and durable haematopoiesis to ensure the long-term survival of the recipient. In some cases, in order to ensure a sufficient number of progenitor cells, an ex vivo expansion step (cell culture) of the hematopoietic graft is required. However, such procedure leads to the loss of HSCs due to their cell division in culture and simultaneous differentiation . Conceptually, HSCs have the ability to self-renew according two different modes: the asymmetric self-renewal, which initiates the generation of a stem cell and of a more differentiated progenitor cell and the symmetric self-renewal, which will allow the generation of two daughter stem cells functionally identical to the mother cell. The study and understanding of these two mechanisms are essential for knowledge in basic research, but also in the context of ex vivo expansion of hematopoietic graft. This is why the work carried out during this thesis aimed at 1- optimizing ex vivo expansion protocols thanks to the use of molecules shown to be effective in the maintenance and amplification of HSCs and 2- analysing by a single cell transcriptomic study the HSC-enriched population arising from ex vivo expansion. These different analyses allowed to shed light on the mechanisms, linked to self-renewal and maintenance of stemness, involved in the ex vivo amplification of primitive cells. Concerning first part of this research, we showed that the addition of an inhibitor of C-Jun N-terminal Kinase (JNK-IN-8 = IN8) together with an antioxidant molecule (Alpha Lipoic Acid = ALA) to the culture medium for 12 days, allowed a 5-fold increase in the expansion of the primitive cells (characterised by the presence of the CD34 membrane antigen) compared to control culture conditions. Furthermore, the pool of CD34+ cells generated by the culture in the presence of the IN8+ALA combination, allowed a significant increase in engraftment and human haematopoietic reconstitution assessed in immunodeficient mice 16 weeks after transplantation. These results allowed us to hypothesize that the IN8+ALA combination increased the number of HSCs during the expansion step, potentially by promoting self-renewal based on a symmetrical self-renewal. The second part of this work focused on the study of the mechanisms and signalling pathways involved in the amplification of CD34+ cells in the presence of IN8 and/or ALA. We therefore performed an in-depth study of the transcriptome of CD34+ cells: (i) freshly isolated, (ii) after 6 hours of culture with or without IN8 and ALA alone and in combination, (iii) as well as after 12 days of culture in the presence of the IN8+ALA combination. The results showed an increase in the expression of genes related to dynamism and maintenance of cytoskeletal integrity, a decrease in genes related to differentiation as well as an increase in genes related to the maintenance of stem capacity, notably through the activation of the WNT/β-catenin pathway known for these effects.